張靈利，何艷杰，李 紅

1.遼寧省朝陽市中心醫(yī)院（朝陽120000）；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（沈陽110032）

幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，HP）被世界衛(wèi)生組織列為一類致癌病原體［1］。在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，認(rèn)為HP是一種“邪氣”，侵入機體后會導(dǎo)致機體出現(xiàn)脾胃濕熱、肝胃不和等中醫(yī)證候，而中醫(yī)證候可動態(tài)反應(yīng)疾病微觀變化［2］。HP 屬于“痞滿”、“胃脘痛”范疇，病因多為飲食不節(jié)，病機為脾胃升降失調(diào)、血瘀氣阻等，而血淤氣阻、郁熱等病理變化可促進(jìn)HP 附著、繁殖，為疾病發(fā)生提供客觀條件。基質(zhì)金屬蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）屬于MMPs家族，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用，參與炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生，同時具有修復(fù)、重塑細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)作用［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1（Tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1）是MMPs抑制劑，對MMP-2表達(dá)水平及活性起到抑制作用［4］。本研究旨在通過觀察HP相關(guān)胃病不同中醫(yī)證候患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1的表達(dá)情況，初步分析兩者表達(dá)臨床意義，為不同中醫(yī)證候發(fā)病機制提供一定參考價值。

資料和方法

1 一般資料 選取本院2018年10月至2019年10月期間收治的HP 相關(guān)胃病患者58 例為研究對象，根據(jù)中醫(yī)證候不同分為脾胃濕熱證組、脾胃不和證組和肝胃不和證組。脾胃濕熱證組23 例，其中男性10例，女性13例；年齡29～58歲，平均年齡（42.08±8.64）歲；胃炎17例，胃潰瘍5例；病程4～31年，平均（17.53±6.75）年。脾胃不和證組18例，其中男性8例，女性10 例；年齡30～60 歲，平均年齡（42.78±8.70）歲；胃炎14例，胃潰瘍4例；病程3～32年，平均（17.61±6.88）年。肝胃不和證組17例，其中男性7例，女性10 例；年齡28～60 歲，平均年齡（42.51±8.76）歲；胃炎14例，胃潰瘍3例；病程4～33年，平均（17.72±6.94）年。各疾病組性別、年齡、病種及病程比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。另選取同期來本院體檢的健康志愿者20例作為對照組，其中男性8例，女性12例；年齡27～60歲，平均年齡（41.72±7.13）歲。對照組與各疾病組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國慢性胃炎共識意見》［5］中慢性胃炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)或符合消化性潰瘍相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；年齡范圍在18～60歲之間；中醫(yī)辨證診斷為脾胃濕熱證、脾胃不和證或肝胃不和證；所有患者對本研究充分知情，并自愿簽署病人知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心腦血管系統(tǒng)、肝腎系統(tǒng)等內(nèi)科疾病者；年齡超出18～60歲范圍者；近期接受抗生素、抑酸藥、質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、非甾體類抗炎藥等相關(guān)治療；妊娠期和哺乳期女性；具有心理疾病史、精神疾病史者；依從性較差，不配合研究者。

2 研究方法

2.1 胃黏膜標(biāo)本獲?。核惺茉囌呔捎肎IFXQ260型電子胃鏡進(jìn)行檢查，并鉗取胃大彎、胃小彎側(cè)（胃竇距幽門約2 cm 處）2塊胃黏膜組織，面積約為0.1 cm2，分別進(jìn)行HP快速尿素酶檢測和美籃染色法檢測。HP感染檢測，即快速尿素酶檢測：取出胃黏膜組織塊后，迅速將其放入檢測試劑中，觀察試劑顏色變化，若試劑由黃色變?yōu)榧t色，提示為HP 陽性，若試劑顏色不變，提示為HP 陰性。快速尿素酶檢測試劑盒購自上海撫生實業(yè)有限公司。美藍(lán)染色法檢測：取出胃黏膜組織塊后，將其浸于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，常規(guī)脫水后進(jìn)行石蠟包埋，并切片，切片厚度約為4 μm。切片常規(guī)脫蠟至水，滴加1%美藍(lán)溶液，染色5～10 min，采用自來水將染料清洗干凈，常規(guī)脫水、二甲苯透明，自后采用中性樹膠封片，在鏡下觀察染色情況，若觀察到藍(lán)色彎曲桿菌，提示為HP陽性。本研究快速尿素酶檢測和美藍(lán)染色法檢測均提示HP陽性者視作HP陽性，否則為HP陰性。

2.2 胃黏膜炎癥狀態(tài)檢測：采用HE染色法觀察胃黏膜炎癥狀態(tài)。具體步驟如下：獲取的胃黏膜組織塊浸于4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定，然后常規(guī)脫水、透明石蠟包埋，并切片，二甲苯及梯度酒精脫蠟至水，蘇木素溶液染色15 min 左右，鹽酸乙醇分化30 s，伊紅溶液染色1～2 min，采用自來水將染料清洗干凈，再經(jīng)常規(guī)脫水、透明后，采用中性樹膠封片，在鏡下觀察胃黏膜炎癥狀態(tài)。胃黏膜炎癥程度分為輕度、中度及重度，每個切片均由2名病理科醫(yī)師獨立進(jìn)行診斷，當(dāng)診斷結(jié)果不一致時，共同探討得出最終診斷結(jié)果。

2.3 胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達(dá)水平檢測：采用免疫組化SP 法檢測胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達(dá)水平。具體步驟如下：同HE染色制作切片，常規(guī)脫蠟至水，采用3%H2O2處理10 min使內(nèi)源性過氧化物酶失活，沖洗3次后，采用置于0.01 M 枸櫞酸緩沖液中加熱（95℃）處理20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，待冷卻，采用羊血清工作液于室溫下進(jìn)行封閉，滴加一抗，4℃孵育12 h，沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h，沖洗3次，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫下孵育1 h。DAB 顯色5-8 min，自來水充分沖洗以終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，在鏡下觀察染色情況，并采用圖像分析系統(tǒng)分析胃黏膜組織中MMP-2、TIMP-1 表達(dá)水平，以染色指數(shù)表示。鼠抗人MMP-2一抗和鼠抗人TIMP-1一抗均購自廈門研科生物技術(shù)有限公司。免疫組化試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)推斷。計量數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，且方差齊，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗。計數(shù)數(shù)據(jù)百分率（%）表示，多組比較采用卡方檢驗，多組間兩兩比較采用卡方分割法比較。等級數(shù)據(jù)用例數(shù)表示，多組間比較采用秩和檢驗，多組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，均為雙側(cè)檢驗。

結(jié) 果

1 不同中醫(yī)證型患者HP檢出情況 不同中醫(yī)證型患者HP 感染率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 不同中醫(yī)證型患者HP檢出情況

2 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜炎癥反應(yīng)程度 各組間胃黏膜炎癥反應(yīng)程度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與對照組相比，脾胃濕熱證組、脾胃不和證組和肝胃不和證組胃黏膜炎癥反應(yīng)程度均較為嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與肝胃不和證組相比，脾胃濕熱證組、脾胃不和證組胃黏膜炎癥反應(yīng)程度均較輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達(dá)情況 各組間胃黏膜MMP-2表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），各組間胃黏膜TIMP-1表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），脾胃濕熱證組、脾胃不和證組和肝胃不和證組胃黏膜TIMP-1表達(dá)水平均高于對照組，脾胃不和證組和肝胃不和證組胃黏膜TIMP-1表達(dá)水平均高于脾胃濕熱證組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜炎癥反應(yīng)程度（n）

表3 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達(dá)情況

表3 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達(dá)情況

注：與對照組比較，*P＜0.05；與脾胃濕熱證組比較，＃P＜0.05

組 別 n MMP-2 TIMP-1脾胃濕熱證組 23 1.93±0.56 1.62±0.51*脾胃不和證組 18 1.96±0.60 1.86±0.57*＃肝胃不和證組 17 1.94±0.58 1.82±0.55*＃對照組20 1.77±0.41 1.24±0.32

4 胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達(dá)與HP 感染、胃黏膜炎癥反應(yīng)程度關(guān)系分析 MMP-2 表達(dá)水平與HP感染無明顯相關(guān)性（r=-0.085，P＞0.05），與胃黏膜炎癥反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.201，P＜0.05）。TIMP-1表達(dá)水平與HP 感染呈正相關(guān)（r=0.182，P＜0.05），與胃黏膜炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)（r=0.268，P＜0.05）。

討 論

臨床常采用三聯(lián)療法或四聯(lián)療法對HP感染進(jìn)行根治，但存在毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性、復(fù)發(fā)率較高等缺點，所以臨床醫(yī)師逐漸將研究重點轉(zhuǎn)向中醫(yī)辨證治療患有HP相關(guān)性胃病的患者［7-9］。

《胃脾論》中指出脾胃衰而百病生，《內(nèi)經(jīng)》中指出正氣存內(nèi)、邪不可干，以上提示中醫(yī)理論體系的重要組成部分為脾胃學(xué)說，脾胃損傷為內(nèi)在病因，邪氣等為外在病因，當(dāng)機體正氣不足時，易導(dǎo)致邪氣入侵，從而引發(fā)疾病。HP相關(guān)性胃病在中醫(yī)學(xué)中屬于“痞滿”、“胃脘痛”范疇，病機主要是脾胃升降失調(diào)、氣機阻滯，本質(zhì)為本虛標(biāo)實，本虛指的脾虛，標(biāo)實指的本虛基礎(chǔ)上形成的一系列病理變化（如血瘀、氣滯、濕阻等）［10］。HP在中醫(yī)學(xué)中將其歸屬于“邪氣”，可引起許多胃部疾病發(fā)生。人類體質(zhì)有9種基本類型，即氣虛質(zhì)、氣郁質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、平和質(zhì)、濕熱質(zhì)、癖血質(zhì)、痰濕質(zhì)和特稟質(zhì)。脾胃濕熱證主要表現(xiàn)為濕熱質(zhì)，脾胃不和證、肝胃不和證主要表現(xiàn)為氣郁質(zhì)［11］。有研究顯示，且HP感染與HP相關(guān)性胃病中醫(yī)證型存在一定關(guān)系，HP 相關(guān)性胃病中脾胃濕熱證為主要中醫(yī)證候型［12］。本研究結(jié)果顯示，脾胃濕熱證組HP 感染率高于脾胃不和證組、肝胃不和證組，但無明顯差異，可能與本研究納入病例數(shù)較少有關(guān)。

HP侵入機體后會損傷胃黏膜，引起不同程度炎癥反應(yīng)，本研究結(jié)果顯示，不同證型組炎癥反應(yīng)程度均強于對照組，且疾病組中肝胃不和證組炎癥反應(yīng)程度最強，提示HP感染相關(guān)性胃疾病患者均表現(xiàn)出不同程度炎癥損傷，其中肝胃不和證患者表現(xiàn)最為明顯。分析原因，肝胃不和證患者情緒控制不佳，易動怒，從而導(dǎo)致氣機不暢，中焦氣機運行異常，肝氣犯胃，所以該類患者胃黏膜炎癥反應(yīng)相對于脾胃濕熱證和脾胃不和證患者更為嚴(yán)重。

MMPs能將細(xì)胞外基質(zhì)降解，TIMPs則可抑制MMPs活性，兩者相互制約，共同維持細(xì)胞外基質(zhì)分泌與降解平衡［13-14］。MMPs和TIMPs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究較多，MMP-2作為MMPs的重要成員之一，活化后能破壞細(xì)胞基底膜，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移，而TIMP-1 可將此過程抑制。但關(guān)于MMP-2 和TIMP-1在HP相關(guān)胃部疾病中表達(dá)水平的研究相對較少。MMP-2不僅與腫瘤發(fā)生有關(guān)，在生理生長及病理損傷過程中還扮演者塑性和修復(fù)角色。蘇玲玲等［15］研究觀察到MMPs表達(dá)于腺體、固有膜及上皮細(xì)胞中，且胃部炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重，遷移至上皮細(xì)胞的MMPs表達(dá)水平越高，認(rèn)為MMPs可能通過類似細(xì)胞遷移的作用對胃黏膜起到保護作用。TIMP-1 作為MMP-2的內(nèi)源性抑制劑，當(dāng)炎癥反應(yīng)加劇時，TIMP-1水平明顯升高。生理狀態(tài)下，當(dāng)胃部出現(xiàn)病理損傷時，MMP-2表達(dá)水平應(yīng)明顯上調(diào)以發(fā)揮修復(fù)作用，TIMP-1蛋白則應(yīng)相對表達(dá)水平較低，MMP-2／TIMP-1平衡向MMP-2偏移，從而改善胃黏膜損傷狀態(tài)。但本研究結(jié)果顯示，疾病組MMP-2表達(dá)水平有所升高，但無明顯差異，TIMP-1表達(dá)水平則明顯升高，提示MMP-2／TIMP-1平衡向TIMP-1偏移，從而促進(jìn)HP 相關(guān)性胃病胃黏膜損傷加重，疾病進(jìn)一步發(fā)展。為了進(jìn)一步明確檢測MMP-2 和TIMP-2 表達(dá)的臨床意義，本研究經(jīng)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)MMP-2與胃黏膜炎癥反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān)，TIMP-1 與胃黏膜炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)，提示MMP-2水平越低、TIMP-1水平越高，胃黏膜炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。

綜上所述，HP 相關(guān)胃病患者存在 MMP-2／TIMP-1失衡現(xiàn)象，MMP-2 具有胃黏膜保護作用，TIMP-2可抑制MMP-2活性，與HP感染及胃黏膜炎癥程度呈正相關(guān)，前者類似于中醫(yī)學(xué)中的“正氣”，后者類似于中醫(yī)學(xué)中的“邪氣”。而不同中醫(yī)證候MMP-2、TIMP-1表達(dá)水平略有差異，可能與不同中醫(yī)證候發(fā)病機制不同有關(guān)，本研究還需進(jìn)一步擴大病例數(shù)進(jìn)行研究。