蔡之幸，陳 越

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院中醫(yī)科（上海200336）

慢性低度炎癥狀態(tài)是代謝綜合征（Metabolic syndrome，MS）存在的重要發(fā)病機(jī)制之一［1］。在肥胖的代謝綜合征患者血清中，多種脂肪細(xì)胞炎癥因子和血清炎癥標(biāo)志物如IL-6、TNF 等呈現(xiàn)明顯地高表達(dá)狀態(tài)。脂肪組織作為一個(gè)內(nèi)分泌器官［2］已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界的共識(shí)。對(duì)抗脂肪組織的慢性炎性狀態(tài)，有利于對(duì)胰島素抵抗的調(diào)控，最終將預(yù)防代謝綜合征患者的心腦血管等重要靶器官損傷事件的發(fā)生發(fā)展。

傳統(tǒng)中藥飲片中，具有清熱燥濕作用的黃連和具有益氣作用的人參是中醫(yī)臨床治療2型糖尿病的常用藥對(duì)。已有多方研究發(fā)現(xiàn)［3-4］黃連的主要有效成分小檗堿具有降低3T3-L1脂肪細(xì)胞TNF-α、IL-6等表達(dá)的作用，而人參的主要有效成分，人參皂苷［5］可通過多種分子機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)糖、脂代謝的作用。目前，該藥對(duì)合用，對(duì)MS患者的干預(yù)，在分子生物學(xué)層面，是否有確切的增效作用，鮮有報(bào)道，人參的主要有效化學(xué)成分人參皂苷Rb1和黃連的主要有效成分小檗堿合用對(duì)脂肪細(xì)胞信號(hào)通路的作用并不十分清楚。本研究，主要從細(xì)胞生物學(xué)層面，觀察兩種主要有效成分的合用對(duì)改善脂肪細(xì)胞的慢性炎性狀態(tài)下的胰島素抵抗是否有增效作用。

材料和方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：人參皂苷Rb1（簡稱Rb1）、小檗堿（簡稱Ber）、地塞米松（DXMS）、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤（IBMX）；重組人胰島素（常規(guī)型，優(yōu)泌林R）；牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）；胎牛血清（FCS）、高糖培養(yǎng)基（DMEM）；抗β-actin單克隆抗體，抗IKK-β單克隆抗體，抗IKK-α／IKK-β多克隆抗體，羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）連接的二抗；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒；3T3-L1前脂肪細(xì)胞株，購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要儀器：通用電泳儀（E-1101）、伯樂半干轉(zhuǎn)膜儀（125-0143）、BioPhotometer D30核酸蛋白質(zhì)測定儀、高速離心機(jī)（E2720）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化：將3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長至70%融合度，消化細(xì)胞種植于6 孔板中，用前體細(xì)胞培養(yǎng)液（90%DMEM+10%FCS）繼續(xù)培養(yǎng)48 h。更換前體細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h至細(xì)胞完全融合。待細(xì)胞完全融合后，更換為分化培養(yǎng)液（90%DMEM+10%FCS+IBMX+1.0μg／ml INS），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，更換分化培養(yǎng)基為脂肪細(xì)胞維持培養(yǎng)基（90%DMEM+10%FCS+1.0μg／ml INS）。將細(xì)胞培養(yǎng)于脂肪細(xì)胞維持培養(yǎng)基中7-15 d，每2-3 d更換維持培養(yǎng)液1 次。誘導(dǎo)分化成熟3T3-L 脂肪細(xì)胞＞70%呈脂肪細(xì)胞表型，可用于實(shí)驗(yàn)（圖1）。

圖1 分化成熟的脂肪細(xì)胞

2.2 建立3T3-L1 脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型：3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化成熟為3T3-L1 脂肪細(xì)胞后，置于0.2%BSA 的DMEM 無血清培養(yǎng)液中，分別加入10μmol／L 小 檗 堿、10μmol／L 人 參 皂 甙Rb1、10μmol／L小檗堿加人參皂甙Rb1干預(yù)24 h，吸棄上清液后，收集經(jīng)藥物干預(yù)的各組脂肪細(xì)胞待用。

3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后，成為成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，先置于0.2%BSA 的DMEM 無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h后，換成含10μmol／L，TNF-α的0.2%BSA 的DMEM 無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)形成胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，再培養(yǎng)12 h后，分別予10μmol／L 小檗堿、10μmol／L人參皂甙Rb1、10μmol／L 小檗堿+人參皂甙Rb1干預(yù)，12 h后，再次吸棄上清液，收集經(jīng)藥物處理的各組胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞待用。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量法檢測mRNA 的表達(dá)量：使用Trizol法抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄提取總m RNA，實(shí)時(shí)熒光定量法測定TNF-α、IL-6 的表達(dá)量。引物（TNF-α上游引物：ACGGCATCCATCTCAAAGAC 下游引物：CGGCAGAGAGGAGGTTGACT；IL-6 上 游 引物：AGTTGCCTTCTTTGGGACTGA 下 游 引 物：CAGAATTGCCATTGCACAAC），PCR 經(jīng)DNA 變性、退火、延伸三步法后，測定其熒光信號(hào)表達(dá)，擴(kuò)增至40個(gè)循環(huán)；根據(jù)熔解度曲線分析擴(kuò)增后的特異性表達(dá)情況，持續(xù)檢測其信號(hào)強(qiáng)度。

2.4 蛋白免疫印跡法（Western-blotting）檢測IKK-β表達(dá)：于上述各組備用的脂肪細(xì)胞中，加入細(xì)胞裂解液，充分裂解各組脂肪細(xì)胞。于4℃下，離心機(jī)設(shè)置13000轉(zhuǎn)／min，離心30 min 后，提取蛋白質(zhì)，運(yùn)用BCA 法，測定蛋白質(zhì)濃度。在蛋白質(zhì)樣品中，加入上樣緩沖液，經(jīng)95℃蛋白變性5 min，分離轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉2 h，使用一抗，4℃度環(huán)境下，孵育過夜，使用二抗室溫環(huán)境下，蛋白質(zhì)雜交2 h，經(jīng)曝光、顯影后，采用蛋白免疫印跡（Western-blotting）法檢測IKK-β表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，符合方差齊性檢驗(yàn)者，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行各組組間比較，若差異顯著者，應(yīng)用LSD 法進(jìn)行兩兩比較；不符合方差齊性檢驗(yàn)者，若差異顯著，則應(yīng)用Tamhane's T2法進(jìn)行兩兩比較。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為兩組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Ber、Rb1及Rb1+Ber干預(yù)對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂肪細(xì)胞炎癥因子的作用 與空白對(duì)照組相比，Ber組脂肪細(xì)胞的TNF-α和IL-6的mRNA 表達(dá)量降低更明顯（P＜0.01），Rb1組脂肪細(xì)胞的TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)量無明顯變化，Rb1+Ber聯(lián)合組的TNF-α和IL-6的mRNA 表達(dá)量亦無顯著變化。見表1。

2 Ber+Rb1干預(yù)對(duì)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的（TNFα刺激）脂肪細(xì)胞炎癥因子的作用 與空白對(duì)照組比較，Ber組能顯著地抑制TNF-α刺激下上調(diào)的TNFα、IL-6的表達(dá)（P＜0.01），而Rb1僅抑制TNF-α的表達(dá)（P＜0.01），Ber+Rb1兩藥合用，與Rb1單用作用類似，僅抑制了TNF-α的表達(dá)（P＜0.01）。見表2。

表1 Ber、Rb1及Rb1+Ber基礎(chǔ)狀態(tài)下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較

表1 Ber、Rb1及Rb1+Ber基礎(chǔ)狀態(tài)下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較

組 別 n TNF-αm RNA 相對(duì)值IL-6m RNA相對(duì)值空白組6 1.17±0.020 1.00±0.022 10μmol／L小檗堿組 6 0.75±0.026 0.80±0.024 10μmol／L人參皂甙組 6 1.17±0.019 1.00±0.020 10μmol／L小檗堿+人參皂甙組 6 1.19±0.015 1.02±0.018 F 值 - 83.04 81.08 P 值 - ＜0.001 ＜0.001

表2 Ber、Rb1及Rb1+Ber在TNF-α刺激下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較

表2 Ber、Rb1及Rb1+Ber在TNF-α刺激下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較

組 別 n TNF-αmRNA 相對(duì)值IL-6mRNA相對(duì)值空白組6 1.00±0.022 1.02±0.029 10μmol／L小檗堿組 6 0.78±0.024 0.88±0.020 10μmol／L人參皂甙組 6 0.81±0.019 1.84±0.020 10μmol／L小檗堿+人參皂甙組 6 0.82±0.016 1.88±0.018 F 值 - 69.47 92.08 P 值 - ＜0.001 ＜0.001

3 Ber、Rb1及Rb1+Ber對(duì)脂肪細(xì)胞主要炎癥信號(hào)通路的影響 經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，加入Ber處理24 h的脂肪細(xì)胞，NF-κB 和IKK-β 表達(dá)水平下調(diào)，而RB1處 理 的 脂 肪 細(xì) 胞（無 論 是 否+Ber），NF-κB 和IKK-β表達(dá)水平上調(diào)。加入TNF-α誘導(dǎo)24 h 后，無論Ber、Rb1處理組或Ber+Rb1聯(lián)合處理組，其磷酸化的IKK-β表達(dá)水平都呈上調(diào)趨勢（圖2）。

圖2 小檗堿和人參皂苷Rb1合用對(duì)脂肪細(xì)胞主要炎癥信號(hào)通路的影響

討 論

代謝綜合征（Metabolic syndromes，MS）是一類以中心性肥胖為核心，聚集了糖耐量異常、高血壓、高血脂、高尿酸等多種心腦血管疾患危險(xiǎn)因素的復(fù)雜代謝紊亂癥候群［6］。胰島素抵抗［7］，是MS公認(rèn)的核心。目前認(rèn)為，脂肪細(xì)胞的堆積［8］使得脂肪組織中的單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）及單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子（MIF）被釋放，導(dǎo)致脂肪組織直接被巨噬細(xì)胞浸潤，在局部脂肪組織產(chǎn)生了大量的活性氧物質(zhì)［9］，減少了抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生。局部脂肪組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)被激活，核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）被激活，諸多脂肪因子，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、瘦素、脂聯(lián)素的分泌異常，這些脂肪因子同時(shí)也是炎性因子，長期慢性釋 放 入 血［10-11］，TNF-α 可 通 過 激 活 核 因 子-κB（NF-κB）抑制因子激酶（IKK），使κB 抑制因子（IKB）磷酸化而激活NF-κB，而NF-κB 又可促進(jìn)TNF-α轉(zhuǎn)錄，從而形成低度炎癥信號(hào)的正反饋環(huán)，導(dǎo)致或加重胰島素抵抗。在長期慢性低度炎性反應(yīng)刺激下，最終能導(dǎo)致MS的產(chǎn)生。

盡管MS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)早已提出，MS 的心腦血管危害性也一再受到重視，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)代謝綜合征的治療，近20年仍停留在針對(duì)某一癥候的各組治療，如單純控制體重、控制血糖、控制血壓、調(diào)脂固斑等，因代謝綜合征患者存在心腦血管事件的高危風(fēng)險(xiǎn)，許多患者不得不選擇上述藥物的疊加給藥，且終身給藥?；凇罢w觀念”的中醫(yī)藥，在“代謝綜合征”的管理上，具有獨(dú)到優(yōu)勢。中醫(yī)認(rèn)為，黃連，苦寒之品，歸心肝胃經(jīng)，既能清熱燥濕，又善清心胃之火。人參，性甘，微溫，有大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益肺的功效，助運(yùn)化，輸精微，使氣旺津生，以達(dá)到生津止渴的目的，能夠針對(duì)MS患者肺脾之虛，補(bǔ)肺平喘又健脾調(diào)中，鼓舞脾氣。黃連、人參相須為用，此藥對(duì)主導(dǎo)的清熱益氣法對(duì)代謝綜合征積極作用被許多學(xué)者認(rèn)可［12］。

本實(shí)驗(yàn)中，我們利用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，再次驗(yàn)證了Ber對(duì)脂肪細(xì)胞主要的炎性通路NF-κB 的下調(diào)作用。在臨床實(shí)踐中取得良好降糖療效的人參，其主要成分人參皂苷Rb1，卻能明顯上調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞炎性通路NF-κB和IKK-β的表達(dá)水平，并且其磷酸化的IKK-β表達(dá)水平都呈上調(diào)趨勢。當(dāng)Ber聯(lián)合Rb1時(shí)，這種上調(diào)趨勢仍然沒有改變。這與臨床實(shí)踐中觀察到的黃連、人參藥對(duì)有降低胰島素抵抗的作用不符［13-14］?？梢姡藚⒌闹饕行С煞諶b1，并非從脂肪細(xì)胞炎性通路NF-κB的調(diào)節(jié)角度，實(shí)現(xiàn)其改善胰島素抵抗的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rb1主要作用于PI3K／Akt信號(hào)通路，促進(jìn)GLUT1、GLUT4蛋白表達(dá)和Akt磷酸化實(shí)現(xiàn)其胰島素抵抗作用［15-16］，同時(shí)，人參皂苷Rb1及代謝物還可通過降低IRS1絲氨酸磷酸化、增加PI3K 活性、促使Akt活化來提高葡萄糖攝?。煌瑫r(shí)抑制炎性反應(yīng)，達(dá)到改善IR 的目的。

NF-κB是機(jī)體的主要炎性通路之一。本研究未顯示出人參皂甙Rb1對(duì)NF-κB通路的下調(diào)作用，恰恰相反，我們觀察到人參皂甙Rb1有上調(diào)脂肪細(xì)胞炎性通路NF-κB 和IKK-β 的表達(dá)水平及上調(diào)磷酸化的IKK-β表達(dá)水平的趨勢，這能否否認(rèn)人參皂甙Rb1的降糖作用？能否可因人參皂甙Rb1無論是否聯(lián)合小檗堿均有上調(diào)脂肪細(xì)胞炎性通路NF-κB 和IKK-β的表達(dá)水平及上調(diào)磷酸化的IKK-β表達(dá)水平的趨勢，認(rèn)為相互疊加的中藥有效成分，有助增長脂肪細(xì)胞炎性反應(yīng)，增加胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)合前述人參皂甙Rb1 在PI3K／Akt胰島素信號(hào)傳導(dǎo)上的研究［15-16］，我們認(rèn)為中藥的有效成分對(duì)脂肪細(xì)胞炎性反應(yīng)及胰島素抵抗的調(diào)控是多方面的；本研究中人參皂甙Rb1的胰島素抵抗作用并不是通過對(duì)脂肪細(xì)胞NF-κB 通路的“抗炎”這條途徑完成的。由此我們想到：中藥的有效成分對(duì)單一信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用與臨床所見的療效可能不盡相同。同一中藥的有效成分，可以作用于多條信號(hào)通路，發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用［17］。中藥有效成分對(duì)信號(hào)通路的影響，并非“1對(duì)1”的線性關(guān)系，也非“1+1”的增效關(guān)系，而是復(fù)雜的、相互作用的“非線性”關(guān)系。或許用“非線性”［18］方式來研究藥物作用于靶標(biāo)及信號(hào)通路中的困惑，可能為中藥有效成分對(duì)疾病的積極作用研究提供途徑。