李棟梁 舒月力 韓琳潔

摘要：以蒸汽爆破預(yù)處理（2.2 MPa，6 min）的小麥秸稈（SEPW）作為原料，對其進(jìn)行高固體含量酶解。經(jīng)過一系列的單因素試驗(yàn)及雙因素正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)添加表面活性劑聚乙二醇6000（PEG6000）使SEPW的酶解效率在低纖維素酶添加量下有明顯提高。在反應(yīng)體系為30 g、葡聚糖添加量為10%、纖維素酶添加量為10 FPU/g葡聚糖時(shí)，SEPW的葡聚糖及木聚糖轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到54.43%、52.63%，相比于對照組的45.79%、22.75%，分別提高18.87%、131.34%。

關(guān)鍵詞：小麥秸稈;蒸汽爆破預(yù)處理;酶解;表面活性劑;高固體含量

中圖分類號(hào)： S188+.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）03-0266-07

小麥秸稈產(chǎn)量豐富，但是利用效率極低，現(xiàn)階段主要通過粉碎還田、喂養(yǎng)牲畜及堆肥發(fā)酵進(jìn)行處理[1-14]。隨著科技進(jìn)步，新型的物理、化學(xué)及生物預(yù)處理技術(shù)給高效利用這種高產(chǎn)量的生物質(zhì)能源提供了便利。如微波粉碎預(yù)處理、熱水預(yù)處理、蒸汽爆破（汽爆）預(yù)處理、堿處理、酸處理、生物預(yù)處理及綜合預(yù)處理等[2]。蒸汽爆破預(yù)處理被廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)預(yù)處理，其具有不產(chǎn)生廢棄物、無需額外添加化學(xué)試劑、預(yù)處理成本低、環(huán)境友好等特點(diǎn)。經(jīng)過汽爆預(yù)處理后小麥秸稈的表面結(jié)構(gòu)被破壞，極大提高了纖維素酶與纖維素的結(jié)合效率[4]。研究如何減少纖維素酶用量及提高纖維素酶利用率，從而降低酶解過程的成本，一直以來受到極大關(guān)注[5]。

目前大多數(shù)研究表明，表面活性劑主要通過降低木質(zhì)素對纖維素酶的無效吸附，提高纖維素酶的酶解效果[6]。本試驗(yàn)通過研究表面活性劑聚乙二醇6000（PEG6000）對汽爆小麥秸稈酶解的影響[13-16]，并通過一系列的單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化搖瓶酶解的條件[17-21]，從而提高高固體含量汽爆小麥秸稈的酶解效率[15]，以期為高固體含量下生物質(zhì)糖化發(fā)酵成本的降低做出貢獻(xiàn)[7-9]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、主要儀器及試劑

小麥秸稈采自河北省滄州市滄縣。纖維素酶（19.89 FPU/mL）由湖南尤特爾生化有限公司友情提供。

主要儀器：臺(tái)式連續(xù)投料粉碎機(jī)（DF-15），購自溫嶺市林大機(jī)械有限公司;電子天平（FA2004）、分析天平（JH1102）、pH計(jì)（PHSJ-4A）等，均購自上海精密科學(xué)儀器有限公司;水分儀（MJ33），購自梅特勒-托利多;蒸汽爆破設(shè)備（QBS-200B），購自鶴壁市正道生物能源有限公司;搖床（ZWYR-D2401），購自上海智城分析儀器制造有限公司;真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]，購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey），購自美國 LI-COR 公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱（DH-101）、電熱恒溫干燥箱（DH-204），均購自天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;高速冷凍離心機(jī)（CR22G），購自日本日立公司;臺(tái)式高速離心機(jī)（TGL-16G），購自上海醫(yī)用分析儀器廠;恒溫水浴鍋（HH-2），購自常州市凱航儀器有限公司;掃描電鏡（JSM-6360），購自日本電子株式會(huì)社（JEOL）。

主要試劑：氫氧化鈉，購自天津市化學(xué)試劑一廠;酒石酸鉀鈉、鹽酸，均購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;濃硫酸，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;十二烷基磺酸鈉，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;檸檬酸、檸檬酸鈉、木糖，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;疊氮化鈉，購自北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖、木聚糖酶，均購自Sigma公司;阿拉伯糖，購自VETEC公司;微晶纖維素、蛋白測定試劑盒，均購自天津鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥秸稈預(yù)處理 小麥秸稈剪切至2～3 cm 長的小段，備用。蒸汽爆破設(shè)備為5 L的反應(yīng)釜，每次加入秸稈200 g，設(shè)定處理時(shí)間為6 min，處理壓力為2.2 MPa。蒸汽爆破后收集物料用去離子水清洗至中性，晾干粉碎過40目篩，4 ℃保存。

1.2.2 纖維素酶活性測定 纖維素酶活性采用二硝基水楊酸（DNS）法[8]進(jìn)行測定。

1.2.3 酶解 將經(jīng)預(yù)處理的小麥秸稈粉末加入到100 mL的三角瓶中，加入pH值為4.8的檸檬酸鈉緩沖液，反應(yīng)條件為50 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)（本研究中除非特定說明，反應(yīng)體系、葡聚糖添加量、纖維素酶添加量分別為20 g、10%、10 FPU/g葡聚糖）。酶解反應(yīng)120 h，反應(yīng)結(jié)束后，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。取上清，通過高效液相色譜法測定葡萄糖、木糖的含量[11]。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

1.2.4 成分分析 纖維素原料的化學(xué)成分分析采用美國國家能源部可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）的試驗(yàn)方法。

1.2.5 掃描電鏡分析 掃描電鏡觀察預(yù)處理前后及酶解過程中纖維素底物的表面結(jié)構(gòu)。樣品觀察前先噴金處理，電壓為5 kV。

1.2.6 X射線衍射儀分析 用X射線衍射方法分析預(yù)處理前后及酶解過程中纖維素底物的纖維素結(jié)晶度的變化規(guī)律，在2θ=10°～40°范圍內(nèi)掃描，變化速率為2 °/min。結(jié)晶度計(jì)算公式如下：

結(jié)晶度=I002-IamI002×100%。

式中：I002為002衍射晶面2θ=22.8°的強(qiáng)度;Iam為2θ=18.0°散射峰的強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)作圖均采用Origin 9.0制圖軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理前后小麥秸稈主要成分變化

多次稱量可知，固體平均回收率為39.47%，根據(jù)表2計(jì)算得出，葡聚糖回收率為76.21%，木聚糖回收率為19.70%，木質(zhì)素回收率為53.37%，說明汽爆預(yù)處理小麥秸稈（SEPW）能夠去除大量半纖維素及木質(zhì)素，并對纖維素有一定的破壞作用。從表2可以看出，經(jīng)汽爆預(yù)處理后，小麥秸稈的葡聚糖及木質(zhì)素含量升高，但木聚糖含量降低，原因在于木聚糖及其他物質(zhì)如水溶性物質(zhì)及小分子物質(zhì)等在汽爆過程中被去除，因此導(dǎo)致葡聚糖及木質(zhì)素的含量有所上升。大量研究表明，木質(zhì)素及半纖維素的存在會(huì)對纖維素的酶解產(chǎn)生負(fù)面影響[9]。

2.2 預(yù)處理及酶解前后小麥秸稈表觀形態(tài)變化

如圖1所示，未處理的小麥秸稈表面平整光滑，纖維排列規(guī)則有序，物理結(jié)構(gòu)致密（圖1-a）。在蒸汽爆破預(yù)處理后，小麥秸稈的微觀結(jié)構(gòu)有了較大的變化，致密的物理結(jié)構(gòu)消失，結(jié)構(gòu)變得疏松，纖維呈無規(guī)則排列，細(xì)胞內(nèi)部纖維外露（圖1-b），說明蒸汽爆破破壞了纖維素鏈之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使纖維素鏈呈散亂排列。

2.3 預(yù)處理及酶解前后小麥秸稈結(jié)晶度變化

如圖2所示，通常天然纖維素（纖維素Ⅰ）的結(jié)晶區(qū)具有4個(gè)特征峰，分別為101、10ī、002、004，其中101峰和10ī峰的布拉格角分別為14.3°、16.8°，002峰的布拉格角為22.3°，004峰的布拉格角為34.7°，無定型纖維素特征峰的布拉格角為 18.7°。從圖2中可以看出，蒸汽爆破預(yù)處理的小麥秸稈（SEPW）和酶解后汽爆小麥秸稈（ESEPW）的101結(jié)晶峰的形狀變得尖銳，002結(jié)晶峰的形狀變得平緩，通過計(jì)算得知蒸汽爆破預(yù)處理的小麥秸稈（SEPW）和酶解后汽爆小麥秸稈（ESEPW）纖維素結(jié)晶度分別為47.80%、46.54%，而未處理的小麥秸稈的結(jié)晶度為36.47%（表3）。這說明與未處理的樣品相比，蒸汽爆破預(yù)處理的小麥秸稈（SEPW）的纖維素結(jié)晶度增大了，這可能是由于預(yù)處理過程對小麥秸稈中其余組分如木聚糖、水提物的去除造成的。

2.4 補(bǔ)料時(shí)間對汽爆小麥秸稈（SEPW）酶解的影響

補(bǔ)料策略如下：初始加入底物小麥秸稈總量的40%，隨后2次補(bǔ)料分別添加底物總量的30%，共4種補(bǔ)料策略，分別為（6，12）、（6，18）、（6，24）、（12，24） h，括號(hào)中為補(bǔ)料時(shí)間。從圖3中可以看出，（6，12） h的補(bǔ)料策略下，SEPW的酶解效率略高于其他的補(bǔ)料策略，這是可能是由于補(bǔ)料間隔較長時(shí)，酶解產(chǎn)物葡萄糖會(huì)對酶解產(chǎn)生較強(qiáng)抑制。所以選?。?，12） h作為最佳的補(bǔ)料時(shí)間。

2.5 反應(yīng)體系總質(zhì)量對SEPW酶解的影響

從圖4中可以看出，隨著反應(yīng)體系總質(zhì)量的增大，葡聚糖轉(zhuǎn)化率先升高后降低，在反應(yīng)體系總質(zhì)量為30 g時(shí)達(dá)到最高，為49.46%，相比反應(yīng)體系總質(zhì)量為20 g的46.41%，增長6.57%。筆者認(rèn)為，在高固體含量的木質(zhì)纖維素酶解中，反應(yīng)體系總質(zhì)量為30 g時(shí)，能量損失最低，混合效率最高。

2.6 纖維素酶添加量對SEPW酶解的影響

從圖5可以看出，隨著纖維素酶添加量的增加，葡聚糖及木聚糖的轉(zhuǎn)化率均在增加，在30 FPU/g葡聚糖的酶添加量后，基本趨于平緩。在纖維素酶添加量增加到50 FPU/g葡聚糖時(shí)，轉(zhuǎn)化率并沒有明顯增長（60.11%），這與何珣等的研究結(jié)果[15]相似。從圖6可以看出，纖維酶添加量的變化過程中，葡聚糖與木聚糖的轉(zhuǎn)化率具有很強(qiáng)的相關(guān)性。因此不考慮成本，纖維素酶添加量為50 FPU/g葡聚糖時(shí)，葡聚糖轉(zhuǎn)化率最高。

2.7 葡聚糖添加量對SEPW酶解的影響

當(dāng)纖維素酶添加量為10 FPU/g葡聚糖時(shí)，從圖7可以看出，隨著葡聚糖添加量的增加，葡聚糖轉(zhuǎn)化率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)葡聚糖的添加量為5%時(shí)達(dá)到最大。為滿足精餾分離的經(jīng)濟(jì)性要求，乙醇發(fā)酵液的濃度須>4%（質(zhì)量體積比）。為滿足該乙醇濃度的要求，糖的總濃度需要高于8%（質(zhì)量體積比）[22]。但高固體含量酶解時(shí)反應(yīng)體系會(huì)存在無法液化的嚴(yán)重問題，這種問題會(huì)使酶與底物無法混合均勻，進(jìn)而嚴(yán)重影響酶解效率。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡聚糖添加量為11%時(shí)，液化時(shí)間延遲的現(xiàn)象出現(xiàn)。因此，本研究選取葡聚糖添加量為10%作為底物添加量。

從圖8可以看出，在不同的葡聚糖添加量時(shí)，葡聚糖轉(zhuǎn)化率與木聚糖轉(zhuǎn)化率之間有較強(qiáng)的相關(guān)性。后續(xù)研究僅參考葡聚糖轉(zhuǎn)化率作為確定最佳條件的依據(jù)。

2.8 表面活性劑種類對SEPW酶解的影響

從圖9可以看出，PEG6000對汽爆小麥秸稈葡聚糖轉(zhuǎn)化率有較明顯的影響，相對于不添加表面活性劑的對照組，葡聚糖轉(zhuǎn)化率增加8.62%。有研究指出，表面活性劑會(huì)通過提高酶的活性進(jìn)而提高降解效率[23]。但在本研究中，當(dāng)?shù)孜锸俏⒕Юw維素時(shí)，表面活性劑的加入并沒有改變酶解效率（圖10）。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為在木質(zhì)纖維素的酶解過程中，表面活性劑的加入能降低木質(zhì)素與纖維素酶的無效吸附，從而增加纖維素與纖維素酶的接觸概率，進(jìn)而提高酶解效率[24-25]，本研究結(jié)果符合后者的觀點(diǎn)。

2.9 PEG6000添加量對SEPW酶解的影響

從圖11可以看出，PEG6000添加量為0.10%時(shí)，SEPW的酶解效果最佳;在PEG6000的添加量低于0.10%時(shí)，酶解效率隨PEG6000添加量的增加而提高;繼續(xù)增加PEG6000的添加量，酶解效率反而下降。從圖12可以看出，PEG6000對微晶纖維素的酶解沒有明顯的作用。所以本研究最佳的PEG6000添加量為0.10%，此時(shí)葡聚糖的轉(zhuǎn)化率為54.43%。

2.10 SEPW酶解雙因素正交試驗(yàn)結(jié)果

從表4可以得知，纖維素酶添加量為30 FPU/g葡聚糖、反應(yīng)體系為30 g、PEG6000添加量為0.10%時(shí)，SEPW的酶解效率最高。經(jīng)計(jì)算得知，在30 g的反應(yīng)體系中，添加0.10% PEG6000后，在纖維素酶添加量分別為10、15、20、25、30 FPU/g葡聚糖時(shí)，酶解效率分別提高14.19%、7.37%、4.36%、4.28%、2.95%?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著纖維素酶添加量的增加，表面活性劑的作用越來越不明顯。筆者認(rèn)為，隨著纖維素酶添加量的增加，對于整個(gè)反應(yīng)體系，纖維素酶是過量的。在較高的纖維素酶添加量時(shí)，木質(zhì)素對酶的無效吸附在酶解中的影響變低。

3 討論與結(jié)論

筆者發(fā)現(xiàn)，小麥秸稈經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理后，化學(xué)成分發(fā)生變化，纖維素及木質(zhì)素的含量升高，半纖維素的含量降低。小麥秸稈致密的物理結(jié)構(gòu)消失，結(jié)構(gòu)疏松，纖維呈無規(guī)則排列，細(xì)胞內(nèi)部纖維外露。

小麥秸稈經(jīng)過汽爆預(yù)處理后，增加纖維素酶添加量以及表面活性劑的添加量，能夠有效降低木質(zhì)素對酶解的影響，特別是表面活性劑，能夠有效地在低纖維素酶添加量下，提高纖維素酶與纖維素的結(jié)合率，進(jìn)而提高酶解效率。

在最佳反應(yīng)體系下，纖維素酶添加量分別為10、15、20、25、30 FPU/g葡聚糖時(shí)，添加0.10%的PEG6000后，酶解效率分別提高14.19%、7.37%、4.36%、4.28%、2.95%。其中，纖維素酶添加量為10 FPU/g葡聚糖時(shí)，PEG6000對酶解效率的提高最明顯，SEPW的葡聚糖及木聚糖轉(zhuǎn)化率分別為54.43%、52.63%，相比于對照組的45.79%、22.75%，分別提高14.19%、131.34%。

在汽爆小麥秸稈高固體含量的酶解過程中，仍然存在許多問題，如汽爆過小麥秸稈中抑制物的去除，木質(zhì)素的分離成本，酶解過程中過量的二糖和三糖不能被完全降解，汽爆后小麥秸稈結(jié)晶度的提高等，都是需要解決的問題。

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