郭 月,石鳳翎,王明玖,劉嘉偉，倪鵬程，曹克璠

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，草地資源教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培加工高效利用重點實驗室，內(nèi)蒙古自治區(qū)草地管理與利用重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

三葉草屬(Trifolium)，也稱車軸草屬，一年生或多年生草本植物，在全世界溫帶地區(qū)廣泛分布，尤其以非洲南部、南美的溫帶分布較多〔1〕。三葉草屬約有360多個種，大多數(shù)為野生種。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中利用價值較高的約有25種，其中最重要且分布較多的是以紅三葉(TrifoliumpratenseL.)、白三葉(TrifoliumrepensL.)和雜三葉(TrifoliumhybridumL.)為主〔2-5〕。三葉草對食草家畜具有良好的適口性、豐富的可利用碳水化合物及蛋白質(zhì)，被世界多地用作反芻動物的飼料。同時還被廣泛地用于草坪地被和水土保持，其與禾本科牧草進行混播時生長能力良好，這對草地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定發(fā)展起到重要作用。目前從國外引種栽培的三葉草屬牧草占全國三葉草屬種植資源的大部分，約有11種，產(chǎn)于國內(nèi)的三葉草屬種類并不多，目前已知的僅有4種，即白三葉、紅三葉、草莓三葉草(TrifoliumfragiferumL.)和野火球(TrifoliumlupinasterL.)〔6〕。

白三葉含有多種營養(yǎng)物質(zhì)和礦物質(zhì)成分，有較高的飼用、綠化、遺傳育種和藥用價值，具有抗寒、耐旱、耐踐踏、抗雜草等優(yōu)良特性，對于牧草品種改良和新品種的選育具有極其重要的意義〔7〕。紅三葉產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值高、耐刈性強等。在人工混播草地中，紅三葉是禾木科牧草的最理想伴生種，已被大范圍栽培種植〔8〕。紅三葉的形態(tài)發(fā)育，與生物量的形成和營養(yǎng)物質(zhì)的積累密不可分，直立性、株高、分枝數(shù)、生長速度、刈割及栽培措施等都是構(gòu)成紅三葉產(chǎn)量的重要因子。Rumbaugh〔9〕研究表明，叢徑、莖長和分枝數(shù)都是影響牧草產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，并且其與產(chǎn)量極顯著正相關(guān)，其中分枝數(shù)對產(chǎn)量的影響最大。Jones〔10〕指出，植株的分枝速率或分枝密度是影響草產(chǎn)量高低的一個重要因素，故選擇產(chǎn)量時可以以牧草的形態(tài)特征為依據(jù)。

高加索三葉草(TrifoliumambiguumBieb.)忍耐水淹的能力遠高于苜蓿。研究表明，一些能忍受積水和表面流水的高加索三葉草品系，在淹水深達15cm的40d 后，其田間存活率超過80%。由于該物種具有較深的根和發(fā)達的根蘗，水土保持的能力是很強的。它對磷供應(yīng)的依賴程度較低，所以對于不肥沃的受到侵蝕的地區(qū)植被恢復(fù)具有潛在的價值〔11〕。在生產(chǎn)應(yīng)用方面，國外大量的研究表明，高加索三葉草同其他三葉草屬牧草相比，有較低的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和較高的體外干物質(zhì)消化率。研究證實高加索三葉草能夠產(chǎn)生高質(zhì)量牧草，并且提供較好的蛋白質(zhì)組成〔12〕，這對提高混播草地的產(chǎn)量、質(zhì)量以及季節(jié)分配起到十分重要的作用。

蒙農(nóng)三葉草1號(TrifoliumambiguumBieb. Cv.Mengnong No.1)是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)利用高加索三葉草多年選育而成的新品種，于2011年12月通過內(nèi)蒙古自治區(qū)草品種審定委員會審定注冊。該三葉草能夠在內(nèi)蒙古多數(shù)地區(qū)越冬，抗旱能力強，適于栽培。本文簡要總結(jié)了國內(nèi)外三葉草屬牧草育種的概況，以期對今后三葉草屬牧草的育種改良研究提供借鑒作用。

1 國外三葉草屬牧草育種研究進展

三葉草的育種工作開始于20世紀(jì)20年代初。1920年由荷蘭首先培育出Dutch白三葉品種。1927年，丹麥選育出Morsootofee白三葉。進入20世紀(jì)40年代，荷蘭、英國、芬蘭、瑞典、法國等國家先后選育出Fres、Perina、Tammninges、Louisiana、Kenland等數(shù)十個白三葉和紅三葉品種，這些品種大部分是通過自然選擇法選育出的適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂驐l件的生態(tài)型，或是通過混合法選育出的比當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)型優(yōu)良的品種〔2〕。國外多數(shù)研究〔13〕將三葉草生長的持久性(即單株壽命)作為其育種計劃的研究重點，其壽命的長短可直接影響牧草的適應(yīng)性和產(chǎn)量。為了提高持久性，一般都增強抗病蟲害能力，還有就是改變其形態(tài)特征，如白三葉的生育期、耐牧型和匍匐莖等。

紅三葉(T.pratensL.)是世界溫帶地區(qū)的重要牧草，可單獨生長或與雜草混合生長，適應(yīng)各種類型的土壤環(huán)境〔14〕。1989年智利的一個研究中心啟動了紅三葉育種計劃，其主要目標(biāo)是提高植物的存活率、飼草產(chǎn)量和持久性。因為基因型與環(huán)境的生物和非生物因素相互作用可以影響植物的長期表現(xiàn)型，所以紅三葉的育種計劃需要考慮環(huán)境和管理的雙重因素。Ortega研究了不同環(huán)境對植物形態(tài)、植物存活率(植物死亡率)和牧草產(chǎn)量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉在間隔植物的環(huán)境下生存與不經(jīng)常切割的草地之間存在顯著的相關(guān)性〔14〕。

紅三葉是一種天然的二倍體植物，但含有大量合成的同源四倍體培育品種。紅三葉與相關(guān)物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并不像白三葉那樣明確〔15〕。栽培的紅三葉可以根據(jù)染色體倍性水平和開花早期進行分類〔16〕。四倍體品種相對于二倍體表現(xiàn)出較低的可育性(種子形成)，可能是由于多倍體形成和授粉減少。由于紅三葉的栽培歷史較長，且栽培品種與野生(自然)形態(tài)品種的分化較強，因此，地方品種在紅三葉育種過程中的作用比白三葉育種中的作用更為突出。與白三葉一樣，雖然紅三葉與相關(guān)物種之間的種間雜交強度較低，但Abberton〔17〕已開展了幾個種間雜交計劃。主要的經(jīng)驗是通過與更持久的三葉草物種雜交來增加壽命，特別是中間車軸草(TrifoliummediumL.)，該物種以染色體數(shù)目為2n=48～126的多倍體系列出現(xiàn)〔18〕。然而，這些雜交結(jié)果至今沒有明顯的經(jīng)濟影響〔19〕。

國外研究在三葉草抗病品種方面較為深入，目前已研究出抗炭皰病、腐爛病、白粉病、葉斑病和根結(jié)線蟲等多個三葉草品種〔20,21〕。研究者普遍認為利用遺傳效應(yīng)和大田連續(xù)選擇是提高三葉草抗病害能力較有效的方法。關(guān)于紅三葉形態(tài)特征育種方面，一些研究表明為增加莖長，多次經(jīng)過周期選擇大大增加株高。結(jié)果發(fā)現(xiàn)株高明顯增高，但莖的數(shù)量有所下降，植物的單個花序數(shù)增多，而單株的花序數(shù)卻明顯下降。紅三葉輪回選擇效力和遺傳可塑性再次證明，在不產(chǎn)生其他不受歡迎的形態(tài)特征前提下，改變它的某個形態(tài)是極其困難的〔13〕。

研究推斷地中海東部地區(qū)是白三葉和紅三葉的起源中心，而最初發(fā)現(xiàn)的白三葉很可能是品種間長期雜交而成〔16〕。這些三葉草存在一年生和多年生的品種，其物種的多樣性為基因組的闡明和改良提供了潛在的遺傳資源〔18,22〕。白三葉原產(chǎn)于歐洲、歐亞大陸、中東和北非，并在世界許多國家作為一種栽培品種引入。T.occidentale是二倍體(2n=2x=16)多年生品種，被認為可能是白三葉的祖先二倍體親本〔16〕，而另一個二倍體親本被推測為T.nigrescens或T.pallescens，但尚未得到證實。T. occidentale也正在被作為一種模式品種，用來開發(fā)與白三葉復(fù)合體相關(guān)的遺傳和基因組研究〔23〕。

三葉草的遺傳資源，以及它們在紅三葉、白三葉和其他三葉草物種的植物育種中的應(yīng)用是近年來熱點的研究〔15,24,25〕。白三葉在種群間表現(xiàn)出相當(dāng)大的適應(yīng)性變異〔26〕，以及高水平的表型可塑性和種群內(nèi)變異。種群內(nèi)變異比牧草產(chǎn)量及其成分的種群間差異大2到5倍，而種子產(chǎn)量組成部分的差異則更大，這些物種在起源地被收集和評估〔27〕。缺乏遺傳變異本身并不是白三葉育種中的主要問題〔25〕，利用異地遺傳資源是開發(fā)新品種的關(guān)鍵。許多國家都有收集大量的生態(tài)類型，為直接開發(fā)提供了一系列不同葉片大小的適應(yīng)植物類型，或作為與Ladino類型雜交的材料。傳統(tǒng)上，植物育種者通過收集探索獲得新的植物材料，找到可能發(fā)現(xiàn)所需性狀的地理區(qū)域〔17〕。植物育種者也使用基因庫收集作為遺傳物質(zhì)的來源，歐洲中央白三葉數(shù)據(jù)庫(www.ecpgr.cgiar.org)中就包含了存儲在14個歐洲基因庫中的白三葉的基本資料，以及訪問歐洲以外其他基因庫和收藏的門戶〔25〕。

關(guān)于白三葉，Williams已經(jīng)開展了幾個主要項目〔28〕，在新西蘭和英國，旨在將重要的特性引入白三葉。已將白三葉與二倍體一年生植物T.nigrescens(2n=2x=16)進行了雜交，這是一種與白三葉相比種子產(chǎn)量高，具有良好的線蟲抗性，開花豐富的植物〔29〕。將四倍體T.ambiguum材料的根莖性狀導(dǎo)入白三葉內(nèi)，與白三葉親本和對照品種作對比，選育出抗旱性顯著提高的新品系，并改善了飼草品質(zhì)特性〔30-32〕。同時，進行了白三葉和T.uniflorum之間的種間雜種用于改善耐旱性的潛力〔28〕。還有報道表明，白三葉在與高加索三葉草(T.ambiguumBieb.)的可育回交中顯示出了不同的倍性水平〔33〕。近年來，白三葉的突變二倍體祖先品種之間的種間雜交已經(jīng)被用來創(chuàng)造對植物育種有價值的獨特新種群〔33〕。

高加索三葉草(T.ambiguumBieb.)是可以利用根蘗進行強克隆繁殖的多年生三葉草屬牧草，也是一種具有水土保持能力的植物〔12〕，原生在寒冷的高加索山地，在高寒草甸及相對干旱的低海拔禾草草原、土耳其東部和伊朗北部地區(qū)生長〔34〕。高加索三葉草根系發(fā)達，主根入土較深，且具有極強的抗逆性。高加索三葉草種子硬實率高，新收獲的二倍體Summit種子發(fā)芽率很低〔11〕。通過了解播種當(dāng)年高加索三葉草的發(fā)育狀況，發(fā)現(xiàn)不同播種時期高加索三葉草的生長狀況以及地上地下生物量積累有著顯著差異。美國春季播種的高加索三葉草約在56d后可觀測到粉紅色的小節(jié)，播種后63d出現(xiàn)長度小于或等于3cm的根蘗。夏季播種后42d可觀測到粉紅色小節(jié)，100d后出現(xiàn)長度小于3cm根蘗。春季播種的根蘗占地下生物量的10%左右，盡管播種當(dāng)年地上地下干物質(zhì)量很低，但通過選擇高的生物量來提高種苗活力是十分有效的〔35〕。高加索三葉草的另一缺陷是在自然狀況下不能形成根瘤進行生物固氮。只有通過專一根瘤菌接種劑接種才能形成根瘤，或通過和白三葉雜交育種后才能固氮〔36〕，也可與白三葉或豆科牧草混播進行氮替換。澳大利亞相關(guān)研究人員在高加索三葉草引種過程中發(fā)現(xiàn)，結(jié)瘤能力差是高加索三葉草不能固氮的主要問題之一〔37〕。

2 國內(nèi)三葉草屬牧草育種研究進展

我國傳統(tǒng)畜牧業(yè)集中分布在寒冷干旱的北方地區(qū)，不適宜三葉草的建植與推廣，所以三葉草的育種工作開展較晚。隨著南方的草地畜牧業(yè)興起，及其在人工草地建植中的重要作用。20世紀(jì)80年代后，三葉草育種工作逐步開展。初期的主要工作是引入國外優(yōu)良品種、對地方品種進行整理，以及野生三葉草的馴化等。如已登記注冊的地方品種有岷山紅三葉、巴東紅三葉、天水紅三葉、貴州白三葉、巫溪紅三葉和蒙農(nóng)三葉草1號等；野生馴化的有延邊野火球；從國外引進的優(yōu)良品種有Huiz和Ladino白三葉，高加索三葉草等，還培育了鄂牧1號、胡依呵、川引拉丁諾等品種〔6〕。

1992年安利佳等人〔38〕對白三葉愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生的方法和技術(shù)進行了探索。周建明〔39〕對白三葉成熟胚的再生不定芽進行了研究，發(fā)現(xiàn)在低濃度的植物生長素和高濃度的細胞分裂素條件下，白三葉的不定芽可以再生。同年，繼續(xù)對白三葉細胞懸浮培養(yǎng)物誘導(dǎo)不定芽，用來自白三葉未成熟胚的愈傷組織成功建立了細胞懸浮培養(yǎng)系。而后，又利用白三葉的懸浮細胞系進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因研究，得到了載有外源基因的不定芽〔40〕，該研究為白三葉細胞懸浮培養(yǎng)物誘導(dǎo)不定芽的形成提供了理論依據(jù)。1994年，孟玉玲在MS培養(yǎng)基上利用紅三葉的下胚軸再生植株，得到再生率為27%的再生苗；用子葉在B5加6-BA0.1mg·L-1和IBA0.2mg·L-1的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷得到分化率為5～10%的再生植株〔41〕，為下一步更好的進行繼代提供了可靠的依據(jù)。黃紅等人〔42〕用紅三葉和白三葉的葉片作為外植體，篩選出了最佳的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，得到胚性細胞懸浮系。張德炎等人〔43〕也曾建立了白三葉的胚性細胞懸浮系，最終試驗發(fā)現(xiàn)縮短換液的時間(每隔3～4d換液一次)可加快胚性細胞懸浮系的建立。楊麗莉等人〔44〕利用白三葉子葉和下胚軸為外植體進行直接再生，最終發(fā)現(xiàn)下胚軸的分化率高于子葉，達到65%以上，這表明高分化率的下胚軸更適合做三葉草直接再生的外植體。

3 三葉草屬牧草常規(guī)育種方法及進展

3.1 引種馴化

我國從19世紀(jì)末開始從歐美等國家引種三葉草，經(jīng)過適應(yīng)性試驗和長期的選擇，有些品種已經(jīng)成為引種地區(qū)的主要牧草品種。1875年我國自比利時引進巴東紅三葉，在湖北省鄂西地區(qū)經(jīng)多年栽培，馴化而成地方品種。岷山紅三葉是岷山種畜場從美國引進的紅三葉逸散種中整理而成。1953年，四川省巫溪縣紅池壩農(nóng)場的技術(shù)員從美國友人處獲得幾粒巫溪紅三葉種子，后在巫溪紅池壩種植。34年后在紅池壩采集到部分種子，并在當(dāng)?shù)夭シN，后經(jīng)整理而成。我國野生白三葉主要分布在新疆大山北麓濕潤的河灘草地。在吉林省海拔50m的琿春縣的低濕草地集中分布。黑龍江尚志縣、內(nèi)蒙古呼倫貝爾市及貴州、湖北、四川、湖南、山西、陜西等省區(qū)均分布著野生白三葉。研究表明，這些野生類型大都屬于小葉型三葉草，不足的是早熟、產(chǎn)量低、不抗病及抗熱性較差。但經(jīng)過了長期的自然選擇，形成了適應(yīng)于各地自然條件的生態(tài)類型，也是選育新品種的寶貴資源。我國的延邊野火球和貴州白三葉都是由野生種馴化而來〔2〕。

3.2 雜交育種

品種間雜交可以創(chuàng)造基因重組的新類型，為選育新品種提供豐富的變異材料，在提高三葉草飼草和種子產(chǎn)量、改良品種和提高抗逆性等方面具有重要作用〔2〕。紅三葉雜交種具有很大的生產(chǎn)潛力，但分離高配合力的親本，以及昂貴的種子生產(chǎn)費用使其經(jīng)濟效益降低。種間雜交可以引進新基因增加多樣性，最廣泛的白三葉種間雜交計劃是由Williams 和Verry〔13〕利用白三葉×庫拉三葉草啟動的，由肯塔基的Anderson等人、威爾士的Abberton等人和新西蘭的Hussain以及William等人繼續(xù)研究。

1978年，ElizabethWilliams〔45〕通過對高加索三葉草和白三葉的雜交胚進行離體培養(yǎng)，成功獲得可在戶外大量繁殖的雜交后代再生植株。1995年Meredith〔46〕利用雜交胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)，使白三葉與高加索三葉草和白三葉的后代進行回交，成功獲得1粒種子。高加索三葉草在引種試驗中不僅表現(xiàn)出良好的抗寒性，其抗旱能力也值得重視，需要進行評價研究。在引進高加索三葉草的基礎(chǔ)上，從2005年開始，國內(nèi)很多學(xué)者〔47-49〕以蒙農(nóng)三葉草1號為母本，白三葉為父本，通過雜交胚離體培養(yǎng)技術(shù)和一系列組織再生技術(shù)，獲得了雜種F1代植株，并成功進行了營養(yǎng)擴繁，形成數(shù)量較多的植株群體。2012年黃帆等人〔50〕通過遺傳學(xué)和分子標(biāo)記(ISSR)的鑒定，結(jié)果證明了雜種F1是真實的雜交后代。白三葉和蒙農(nóng)三葉草1號親緣關(guān)系較遠，雜交F1代高度不育。經(jīng)過多年探索，蒙農(nóng)三葉草1號與白三葉雜交后獲得F1代植株的技術(shù)難題已被攻克，利用組培繼代和雜交后代很強的克隆繁殖能力，蒙農(nóng)三葉草1號與白三葉雜交后代能夠進行長期實驗室和田間保存。在蒙農(nóng)三葉草1號與白三葉的雜種F1代培育的過程中，出現(xiàn)多葉型(4～5小葉)植株，經(jīng)過進一步的研究，形成多葉型株系。鄔娜等人〔51〕對親本、多葉型株系和普通型株系的營養(yǎng)成分分析，發(fā)現(xiàn)雜種F1代普通型株系和多葉型株系的莖、葉各常規(guī)營養(yǎng)成分含量與母本蒙農(nóng)三葉草1號相近；多葉型株系的莖粗脂肪含量高于普通型株系；普通型株系的水分利用效率低于多葉型株系和親本。

3.3 多倍體育種

三葉草的多倍體育種工作始于20世紀(jì)50年代中后期，其中最有成效的是紅三葉四倍體。在前蘇聯(lián)培育的紅三葉為2n=4X=28。西歐以及美國等國家培育的紅三葉是2n=4X=32。四倍體紅三葉具有抗病、長壽、高產(chǎn)等優(yōu)點。

用秋水仙素處理發(fā)芽種子或幼苗的方法是目前誘導(dǎo)四倍體紅三葉的主要方法。1981年美國學(xué)者W.A.Parrott和R.R.Smith〔2〕采用2n配子的方法獲得四倍體紅三葉，還可用組織培養(yǎng)和體細胞融合等生物工程方法獲得四倍體三葉草。四倍體栽培品種在鮮草產(chǎn)量、粗蛋白含量和持久性方面優(yōu)越，并且通常具有比其二倍體祖先更高的抗病逆性〔52,53〕，但四倍體栽培品種中的纖維素含量不是很高。四倍體的主要缺點是它們的種子產(chǎn)量低。四倍體的分枝較少，因此通常每株植物產(chǎn)生較少數(shù)量的花序〔54〕。最常用獲得四倍體的方法是通過秋水仙素、氧化亞氮(N2O)等化學(xué)試劑處理幼苗。秋水仙素可防止在有絲分裂細胞分裂過程中染色體分離，獲得的這種四倍體稱為有絲分裂四倍體〔55〕。

3.4 分子育種

在20世紀(jì)80年代和90年代，各種類型的分子標(biāo)記，如限制性片段長度多態(tài)性〔56〕(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)〔57,58〕、微衛(wèi)星(microsatellite)和單核苷所多態(tài)性(SNP)被發(fā)展起來。由于它們的豐富性和在植物基因組中的重要性，分子標(biāo)記已經(jīng)被廣泛地用于種質(zhì)評價、遺傳作圖、基于圖譜的基因發(fā)現(xiàn)以及標(biāo)記輔助的植物育種等方面〔59,60〕。分子標(biāo)記已經(jīng)成為農(nóng)藝性狀遺傳操作的一個有力工具〔61,62〕。由2000年擬南芥基因組〔63〕和2002年水稻基因組〔64〕的全基因組測序開始，越來越多的植物的基因組已經(jīng)或者正在被測序。生物信息學(xué)、基因組學(xué)以及各種組學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展正在產(chǎn)生豐富的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在未來可能會引起植物育種的革命。

4 展望

據(jù)不完全統(tǒng)計，目前已選育出的各類三葉草品種約500余個。Williams〔19〕曾報道，早期多采用的是自然選擇和混合選擇育種法，培育適合當(dāng)?shù)刈匀粭l件的生態(tài)型。隨著育種工作的開展，生態(tài)型逐步被各種育種途徑選育的優(yōu)良品種所代替。根據(jù)育種目標(biāo)，采用適當(dāng)?shù)挠N技術(shù)選育新品種，已經(jīng)成為三葉草育種的主要趨勢〔2〕。隨著我國草地畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，生態(tài)環(huán)境建設(shè)力度的加大，選育不同利用目的的三葉草新品種已成為經(jīng)濟社會和生產(chǎn)實踐發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急〔2〕?，F(xiàn)如今，盡管植物分子生物學(xué)研究進展迅猛，前景巨大，但在三葉草牧草育種中的應(yīng)用卻很少。隨著基于DNA的分子標(biāo)記的出現(xiàn)，染色體的廣泛遺傳圖對于許多物種變得容易實現(xiàn)。我們認識到的基因組是高度相似的，這種相似性可以使我們能夠在物種之間預(yù)測基因的位置。因此，可以通過將常規(guī)育種的方法與各種生物技術(shù)相結(jié)合來培育三葉草的品種資源，使我國三葉草育種工作步入新的階段。