侯燕茹，宛 濤*，張曉明，王曉棟,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019； 2內(nèi)蒙古自治區(qū)草原勘察規(guī)劃院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051)

蒙古韭(AlliummongolicumRegel)是百合科蔥屬的多年生草本植物。主要分布在我國新疆、青海、甘肅、內(nèi)蒙古等省區(qū)的荒漠草原地區(qū)。能夠在干旱地區(qū)生長的植物，可以改善環(huán)境，提高環(huán)境質(zhì)量，是解決沙化問題的有效途徑之一〔1〕。蒙古韭具有較高的飼用，藥用以及生態(tài)價值，也是家畜喜食的優(yōu)良牧草，同時它獨(dú)特的氣味也可作為野生蔬菜食用〔2〕。本文以8個不同地理居群的120份蒙古韭作為研究材料，采用SSR分子標(biāo)記法，篩選出多態(tài)性好的引物，對蒙古韭的遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期為蒙古韭的引種馴化及遺傳育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料來自8個不同地理環(huán)境的居群，如表1所示。每個居群隨機(jī)選取15份單株，共120份單株種子。2019年3月至9月，在室內(nèi)進(jìn)行試驗，供試材料在溫室中培養(yǎng)，待幼苗生長至7～10cm時(播種后約40d)剪下葉片以供使用或存放-80℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料信息

表2 供試材料地理分布表

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用改良后的CTAB法對葉片基因組DNA進(jìn)行提取，后用瓊脂糖凝膠電泳，檢測其質(zhì)量及含量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 引物及序列信息

1.2.2 引物篩選與PCR擴(kuò)增

從40對蔥類引物以及Kyung-Ho〔3〕和Lee〔4〕開發(fā)的7對SSR引物中，篩選出10對多態(tài)性較好且較為穩(wěn)定的引物(表3)。初步選定最佳PCR擴(kuò)增程序為：94℃，5min；94℃，30s；40～59℃，30 S；72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃，7min；4℃保存。經(jīng)過實驗優(yōu)化后的SSR-PCR反應(yīng)體系：DNA模板1μ，上下游引物各1.5μL，mix(天根生化科技有限公司生產(chǎn))7μL，ddH2O補(bǔ)足15μL后的反應(yīng)效果最佳。最后從47對引物中篩選出條帶清晰且多態(tài)性較好的引物。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測

擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。首先用剝離硅烷(500μL)涂抹凹板，用親和硅烷(500μ)涂抹平板，待風(fēng)干后將玻璃板固定灌入配好的丙烯酰胺凝膠，25～30℃放置60～90min，可將凝好的膠板直接使用或用保鮮膜封好4℃保存待用。電泳恒定電壓190V，時間75min，待條帶跑至膠板大約2/3處，然后采用銀染色法顯色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)電泳結(jié)果，在凝膠相同遷移率位置上，染色結(jié)果有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”；運(yùn)用Excel軟件構(gòu)成“0，1”矩陣。利用POPGENE version1.32軟件計算有效等位基因數(shù)Ne、Nei’s遺傳同一性、遺傳距離、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)等指標(biāo)，并利用NTSYS pc 21-2軟件進(jìn)行居群間的UPGMA(非加權(quán)組平均法)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物標(biāo)記多態(tài)性確定

使用篩選出的10對SSR引物，對8個居群的120份種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出的多態(tài)性片段長度在40～400bp之間。共擴(kuò)增出130條帶，多態(tài)帶為112條，多態(tài)帶百分率變化范圍在73.3%～100%之間。多態(tài)帶百分率為100%的引物有4對分別是：SSR-3-、SSR-5-、AFS131和SSR-7-。其中引物GB-ASM-072C和AMS12擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，分別是16條和19條；引物AFS131擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，為8條。平均每對引物擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)為11.2個，多態(tài)帶占總條帶的86%，說明10對引物的擴(kuò)增效率很高且都具有較好的多態(tài)性，如表4所示。

表4 引物擴(kuò)增情況

2.2 蒙古韭遺傳多樣性分析

表5中可以看出，在篩選出的10對引物標(biāo)記下，120份單株材料的基因多樣性水平變幅在0.1588-0.3956之間，平均為0.2987；Shannon信息指數(shù)介于0.2637～0.5790之間，平均為0.4599。10對引物的觀測等位基因均為2，有效等位基因變化范圍在1.2633～1.5956之間，平均值是1.4862與觀測等位基因較為接近，說明等位基因均勻分布在群體中。多態(tài)信息指數(shù)(PIC)變幅在0.2490～0.4076之間。在多樣性指標(biāo)以及多態(tài)信息表達(dá)中，引物SSR-6-(I=0.5790，He=0.3946)標(biāo)記下的120份單株材料體現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。除引物B20F12之外，其他引物表現(xiàn)出的基因遺傳多樣性水平基本一致。

表5 基于SSR的引物多樣性分析

120份蒙古韭基因多樣性如表6所示。其中總基因多樣性平均為0.3354，而居群內(nèi)的基因多樣性為0.1499；遺傳分化系數(shù)平均為0.5532，即居群間的遺傳變異占總變異的55.32%；表明蒙古韭遺傳多樣性主要存在于居群間，而居群內(nèi)也存在一定的分化。各位點(diǎn)的基因流在0～13.0889之間，平均為0.4029。

表6 基因多樣性分析

在10對引物的標(biāo)記下，不同居群蒙古韭遺傳多樣性分析如表7所示。居群間基因多樣性變幅處在0.0926～0.1743之間，平均為0.1498；Shannon信息指數(shù)的變幅在0.1394～0.2657之間，平均為0.2248。居群中有效等位基因變化范圍為1.1582～1.3030，較高的是采自內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善左旗的蒙古韭居群，較低的是采自甘肅省武威市古浪縣的蒙古韭居群。根據(jù)2種多樣性指標(biāo)可以看出，采自甘肅省武威市古浪縣的蒙古韭居群的遺傳多樣性明顯較低，采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特右旗和內(nèi)蒙古錫林郭勒盟多倫縣的蒙古韭居群表現(xiàn)出較為豐富的基因多樣性。

表7 遺傳多樣性分析

2.3 遺傳距離分析

從表8中可以看出，各居群之間的遺傳距離在0.1573～0.4748之間，而遺傳一致度則在0.6220～0.8544之間。甘肅省武威市古浪縣和甘肅省張掖市肅南縣喇嘛灣的蒙古韭居群遺傳距離最大，為0.4748，它們之間的遺傳一致度最低，為0.6220。內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特右旗和甘肅省張掖市肅南縣喇嘛灣的蒙古韭居群之間的遺傳距離最小，為0.1573，它們之間遺傳一致度最大，為0.8544。

表8 Nei的同一性和遺傳距離

注：遺傳同一性(上對角線)和遺傳距離(下對角線)

如表9所示，地理距離最近的是河北省承德市圍場縣和內(nèi)蒙古錫林郭勒盟多倫縣，為72km；最遠(yuǎn)的是甘肅省張掖市肅南縣喇嘛和河北省承德市圍場縣，距離為1558km。遺傳距離最近的是內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特右旗和甘肅省張掖市肅南縣喇嘛灣的蒙古韭居群，最遠(yuǎn)的是甘肅省武威市古浪縣和甘肅省張掖市肅南縣喇嘛灣的蒙古韭居群。遺傳距離居群呈現(xiàn)出不一致的分布狀態(tài)，說明地理距離對遺傳距離的影響不大。

表9 居群間地理距離 單位：km

2.4 聚類分析

圖1所示的UPGMA聚類圖是依據(jù)Nei’s遺傳一致度，對8個不同地理居群蒙古韭所進(jìn)行的聚類。內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特右旗和甘肅省張掖市肅南縣喇嘛灣居群蒙古韭居群首先相聚，然后和內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗巴拉貢鎮(zhèn)的蒙古韭居群聚在了一起，再與內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善左旗的蒙古韭居群相聚，最后在較遠(yuǎn)的距離與甘肅省武威市古浪縣的蒙古韭居群聚在一起。內(nèi)蒙古錫林郭勒盟阿巴嘎旗的蒙古韭居群與內(nèi)蒙古錫林郭勒盟多倫縣的蒙古韭居群聚在一起，后又與河北省承德市圍場縣的蒙古韭居群聚在了一起。

表10 種源地地理及氣候信息

且參照表10可以看出，聚類結(jié)果顯示部分距離較近居群與年均溫表現(xiàn)出較為一致性的變化趨勢。聚為一類的內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特右旗的蒙古韭居群、甘肅省張掖市肅南縣喇嘛灣居群蒙古韭居群、內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗巴拉貢鎮(zhèn)的蒙古韭居群、內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善左旗的蒙古韭居群和甘肅省武威市古浪縣的蒙古韭居群年均溫依次為4.3<4.9<6.8<7.2，5.6(甘肅省武威市古浪縣居群的遺傳距離相對同一類群中其他4個居群距離較遠(yuǎn))；聚為一類的內(nèi)蒙古錫林郭勒盟阿巴嘎旗蒙古韭居群、內(nèi)蒙古錫林郭勒盟多倫縣的蒙古韭居群聚與河北省承德市圍場縣的年均溫最低，依次為0.7<1.6<3.3。結(jié)合8個蒙古韭居群的地理分布表2分析得出遺傳聚類結(jié)果與圖中居群地理分布并未呈現(xiàn)規(guī)律性分布。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

遺傳多樣性的研究目前主要集中在分子水平、細(xì)胞水平和個體水平上，而分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前研究遺傳多樣性的重要辦法〔5〕。當(dāng)前蒙古韭在分子水平上正處于初步研究的階段，因而這方面的參考資料相對較為匱乏。本次研究對8個不同地理居群的蒙古韭進(jìn)行了基因多樣性分析，Shannon信息指數(shù)可以看出總的基因多樣性平均為0.4599，與秦麗麗〔6〕的研究結(jié)果相比較，SSR分子標(biāo)記法體現(xiàn)出更為豐富的遺傳多樣性。通過8個居群內(nèi)基因多樣性分析顯示，除了位于緯度最低的甘肅省武威市古浪縣和位于緯度最高的內(nèi)蒙古錫林郭勒盟阿巴嘎旗表現(xiàn)出較低的多樣性水平，其余地理居群基本一致，初步分析地理分布可能影響居群內(nèi)基因多樣性水平。有效等位基因數(shù)也可以反映群體遺傳變異大小，研究結(jié)果顯示有效等位基因數(shù)值接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因在群體中分布均勻。

對于居群而言，遺傳結(jié)構(gòu)是一個物種較為基本的特征，而基因流對其有著重要的影響。群體的遺傳分化可以通過基因流的大小表達(dá)，群體的遺傳結(jié)構(gòu)又被群體的遺傳分化狀況所直接反映〔7〕。Ellstrand et al〔8〕認(rèn)為當(dāng)Nm>1時，基因流可以很好的抵制遺傳漂變，同時能夠有效防止群體之間的分化；當(dāng)Nm<1時，遺傳漂變導(dǎo)致了明顯的群體間遺傳分化，且植物種群的遺傳分化也可以通過地理因子協(xié)同環(huán)境因子的作用而加強(qiáng)。研究結(jié)果顯示蒙古韭的基因流為0.4039(Nm<1)。8個不同居群的120份材料平均分化系數(shù)為0.5532，說明群體間出現(xiàn)了較為明顯的基因分化。導(dǎo)致這種結(jié)果可能是與物種的不同繁殖方式、散粉和種子傳播機(jī)制、地理的特殊分布等有關(guān)。綜合緯度、年均溫、降水量、蒸發(fā)量和海拔等環(huán)境因素分析得出，8個居群的總體生境相差不大，基本上都位于荒漠草原地帶，可能是導(dǎo)致基因分化的原因之一。同時也和人類生活活動密切相關(guān)，蒙古韭作為野生植物，目前還并沒有被大量的開發(fā)使用。因而削弱了群體間的基因交流，且作為異交蟲媒植物，傳粉條件有限，也是可能是致使蒙古韭群體間出現(xiàn)較高的遺傳分化現(xiàn)象的原因。

張瑩花〔9〕在對蒙古韭的分布分析指出，蒙古韭主要分布在陜西、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古、新疆、青海6省(區(qū))，由蒙古韭不同群落的物種組成。本研究通過UPGMA聚類圖將8個居群分為2個類群，表現(xiàn)出居群間的差異性。內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特右旗的蒙古韭居群、甘肅省張掖市肅南縣喇嘛灣的蒙古韭居群、內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗巴拉貢鎮(zhèn)的蒙古韭居群、內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善左旗的蒙古韭居群和甘肅省武威市古浪縣的蒙古韭居群聚為親緣關(guān)系較近的一類，且甘肅省武威市古浪縣的蒙古韭居群在這一類群中相比其他居群距離較遠(yuǎn)；內(nèi)蒙古錫林郭勒盟阿巴嘎旗的蒙古韭居群、內(nèi)蒙古錫林郭勒盟多倫縣的蒙古韭居群、河北省承德市圍場縣的蒙古韭居群，聚為另一類。地理信息及分布圖綜合聚類結(jié)果分析得出，溫度、緯度與遺傳距離有著極為緊密的聯(lián)系，且Jump的遺傳多樣性研究中也發(fā)現(xiàn)，有一個位點(diǎn)的頻率變化與溫度是極為相關(guān)的〔10〕。若遺傳多樣性在緯度梯度分布上與物種多樣性存在一定程度上的一致，可能表明了，有一些驅(qū)動因素是共同存在于兩者之間的〔11〕。研究結(jié)果顯示部分居群遺傳多樣性在緯度梯度分布呈現(xiàn)一致。甘肅省張掖市肅南縣喇嘛灣(I=0.1637)與內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善左旗(I=0.1690)緯度最相近，其基因多樣性也最為接近，說明部分緯度相近的居群存在一定程度的共同驅(qū)動因素。根據(jù)地理信息表與聚類結(jié)果的綜合分析，結(jié)果顯示年均溫度和緯度是遺傳距離的重要影響因素。

3.2 結(jié)論

蔥類SSR引物在蒙古韭材料中的適用性較低，47對引物中僅有10對表現(xiàn)較好，使用率為21%。Shannon信息指數(shù)所反映的基因多樣性平均為0.4599，表明蒙古韭保持較為豐富的遺傳多樣性。遺傳距離與地理生境有關(guān)，特別是與年均溫、緯度等關(guān)系明顯。內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特右旗居群內(nèi)表現(xiàn)出較為突出的遺傳多樣性(He=0.1743，I=0.2657)，具有較高的引種馴化及遺傳育種的科學(xué)價值。