錢亞斯，石鳳翎，閆 偉，喬 雨，張雨桐

(內蒙古農業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院，草地資源教育部重點實驗室， 農業(yè)農村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室， 內蒙古自治區(qū)草地管理與利用重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010019)

豆科植物根瘤菌(Rhizobium)的固氮作用，一方面能提高豆科植物的產量和品質，另一方面可有效提高土壤肥力，使后茬作物生長環(huán)境得到改善〔1〕。根瘤菌對豆科牧草生長發(fā)育有著重要作用，同時可改善土壤理化性質，提高土壤肥力〔2,3〕。豆科植物如缺少與之相匹配的根瘤菌株，則會降低對空氣中氮氣的利用,增加對土壤中化合氮的汲取,從而會降低土壤含氮量，導致土壤肥力衰退，造成植株生長緩慢〔4〕。

近幾年，在甘農3號、公農1號、中苜1號等紫花苜蓿上做了相關苜?；ソ臃N族內根瘤菌接種效果的深入研究〔1,5,6〕，均表明通過接種與之相匹配的根瘤菌菌株，可顯著提高其生產性能。但在草原3號雜花苜蓿上還未進行過相應的研究。草原3號雜花苜蓿在內蒙古地區(qū)具有較強的適應性，是該地區(qū)種植和推廣的主要牧草。為提高其在不同環(huán)境下建植成苗率及牧草產量，通過對溫室接種不同根瘤菌的草原3號雜花苜蓿幼苗的觀察，以期獲得對幼苗生長有促進作用的菌株，為草原3雜花苜蓿的高產栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

1.1.1 根瘤菌采集地的地理位置

根瘤菌采集于4個地點，分別為內蒙古自治區(qū)土默特左旗沙爾沁基地(簡稱沙爾沁)(N40°34′54″,E111°46′54″，海拔1050m)、土默特左旗海流基地(簡稱海流)(N40°31′17″,E111°23′46″，海拔1008m)、呼和浩特市內蒙古農業(yè)大學(簡稱內農大)(N40°41′30″，E111°22′30″，海拔1055m)、達拉特旗關碾房(簡稱關碾房)(N40°19′7″，E109°59′52″，海拔1030m)。

1.1.2 采集地氣候條件

4個采集地的氣候條件接近，均屬典型大陸性氣候，年平均氣溫5.4℃，一月份最冷且極端最低氣溫-33.6℃，七月份最熱且極端最高氣溫36℃；年均日照1600h；年平均降水400mm，多集中在7-9月份，冬季積雪少；無霜期113-134d，初霜期9月中下旬，終霜期5月末。

1.2 寄主植物材料

從北京克勞沃公司購買的苜蓿菌種，代號為DZ，其余均為自采，詳見表2。

表1 各地點采集根瘤的寄主植物

1.3 試驗方法

通過采集不同地區(qū)不同土壤條件下的苜?；ソ臃N族內的根瘤菌，進行純化、鑒定及分類。將純化后的根瘤菌與草原3雜花苜蓿接種，觀察其幼苗生長狀況。具體方法如下：

1.3.1 根瘤采集

在上述4個地點，于苜蓿屬和草木樨屬牧草生長的旺盛期(分枝期-現(xiàn)蕾)，選取健壯植株挖出根部，連同根際土壤一同裝入塑封袋內，帶回實驗室后摘取其根瘤。

1.3.2 根瘤菌純化鑒定

分離培養(yǎng)基(YEMA剛果紅培養(yǎng)基)的配制，參考管鳳貞等的方法〔7〕。將培養(yǎng)基與試驗用具置121℃高壓滅菌鍋中滅菌20min；挑選大而有效的根瘤菌，用無菌水清洗3-4次。利用劃線法將其接種到培養(yǎng)基上，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)。逐日觀察直至篩選出不吸色的單一菌株。參照閆偉等〔8〕的鑒定結果，選取14個菌株進行以下的接種試驗。

1.3.3 接種與幼苗培養(yǎng)

對純化鑒定后的根瘤菌菌落，用無菌水配制OD600nm值大于0.5根瘤菌菌液，與草原3號雜花苜蓿種子進行拌種(浸泡露白后的發(fā)芽種子30min，澆灌3ml菌液)，播種于32穴育苗盤(高11cm、直徑6cm)內的椰磚(滅菌的)上。播種后2周，按出苗數(shù)定量澆灌營養(yǎng)液〔1〕。

1.4 測試指標及方法

出苗后20d～49d每隔7d觀察測定一次幼苗長勢情況，包括絕對高度、葉片數(shù)、葉片寬。出苗后30d對各處理隨機選取10株，測定單株根系有效根瘤菌個數(shù)、根瘤重量、地上生物量鮮重、根系鮮重、根系長。具體測定方法如下：

葉片數(shù)：數(shù)取單株上完全展開的葉片數(shù)量(片)。

幼苗高度：量取植株與地面垂直的最高處的絕對高度(cm)。

小葉的葉片寬：用游標卡尺量取復葉中間小葉葉面最寬處(cm)。

單株地上生物量鮮重：齊地面刈割后置千分之一天平稱重(g)。

根瘤數(shù)及其重量：數(shù)取每一單株根瘤個數(shù)，然后置十萬分之一天平稱重(mg)。

根系長：量取根部最長的主根長度(cm)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和SAS統(tǒng)計軟件，對試驗所得數(shù)據(jù)進行方差分析、聚類分析、相關分析等數(shù)理統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 接種不同根瘤菌對草原3號雜花苜蓿幼苗地上部生長的影響

2.1.1 幼苗高度的變化

由圖1可知，至第49d時，接種不同根瘤菌的草原3號雜花苜蓿幼苗高度有不同程度的差異。接種SJN、DZ、HK菌株的株高較對照略有變高，但顯著高于接種XHC、SWL、SD、DK、XH的幼苗高度，反映出接種根瘤菌與不接種根瘤菌的草原3雜花苜蓿幼苗在株高上的變化不明顯。

由表2可知，至49d時，接種不同根瘤菌的草原3號雜花苜蓿幼苗高度變幅有不同程度的差異。接種SJN、HH菌株幼苗株高變幅略大于對照，但顯著高于接種H7、DC3、H2、XK、H8、SWL、XHC、DK及XH的幼苗；接種根瘤菌與不接種根瘤菌的草原3雜花苜蓿幼苗在株高變幅上的變化不明顯。

表2 接種不同種根瘤菌草原3號雜花苜蓿幼苗株高變幅

注：不含相同的小寫字母表示幼苗根瘤數(shù)之間差異顯著(p<0.05)

2.1.2 幼苗葉片數(shù)的變化

由圖2可知，接種SJN、HK菌株的幼苗其葉片數(shù)與CK及接種DK、XK、XH、XBC、H8、SWL菌種的幼苗葉片數(shù)存在顯著差異，反映出接種根瘤菌與不接種根瘤菌的草原3雜花苜蓿幼苗在葉片數(shù)上的變化有顯著作用。

由表3可知，至49d時，接種不同根瘤菌的草原3號雜花苜蓿幼苗葉片數(shù)變幅有不同程度的差異，接種SJN菌株的幼苗葉片數(shù)變幅顯著高于對照及接種HK和DC3菌株的幼苗。

表3 接種不同種根瘤菌草原3號雜花苜蓿幼苗葉片數(shù)變幅

注：不含相同的小寫字母表示幼苗根瘤數(shù)之間差異顯著(p<0.05)

2.1.3 幼苗葉片寬度的變化

由表4可知，各菌種對其葉片寬度生長的影響存在一定的差異，其中接種SJN、DC3菌株的葉寬較對照略有變寬，但顯著寬于H8、XH、HH菌株的接種效果；總體反映出接種根瘤菌與不接種根瘤菌的草原3雜花苜蓿幼苗在葉片寬度上的變化不明顯。

接種草原3號雜花苜蓿幼苗地上生物量與CK有不同程度的差異。接種XHC、SJN菌株的地上生物量顯著高于CK及其余菌株。其余菌種間以及與CK菌種間均無顯著差異。

表4 接種不同種根瘤菌草原3號雜花苜蓿幼苗單株生物量和葉寬

注：不含相同的小寫字母表示葉片寬之間差異顯著(p<0.05)

2.2 接種不同種根瘤菌對草原3號雜花苜蓿幼苗根部生長的影響

由表5可知，接種不同種根瘤菌的草原3號雜花苜蓿幼苗的根瘤數(shù)、根瘤重量均與CK均有不同程度的差異，其中，接種HK的幼苗根瘤數(shù)顯著高于CK及其余菌種；接種SJN、HK菌株的根瘤重量顯著高于CK及XBC、SWL、SD、HH、H2、H7。

各菌種對其幼苗根系長度的影響存在一定的差異，其中接種SJN、HK菌株的根系長較對照略有增長，但顯著高于H8、HH、XHC、XH、SD、SWL菌株的接種效果?？傮w反映出，接種根瘤菌與不接種根瘤菌的草接種不同根瘤菌草原3號雜花苜蓿幼苗的根系重量與CK均有不同程度的差異。其中DK、SJN菌種的根系重量顯著高于CK及其余菌種。

表5 接種不同根瘤菌草原3號雜花苜蓿生長30d時根部生長情況

注：不含相同的小寫字母表示幼苗根瘤數(shù)之間差異顯著(p<0.05)

2.3 各指標的相關分析

由表6可知，株高、葉寬、生物量與根瘤重之間呈顯著正相關，這表明根瘤重是促進幼苗生長的重要指標；根長、株高與根重之間也存在極顯著或顯著的正相關，根系越長越有利于植株吸收養(yǎng)分，促進幼苗的生長；株高與葉寬之間呈極顯著的正相關，葉片寬度增加，增加了幼苗的光合作用，增加植株養(yǎng)分的積累，促進幼苗生長。

表6 各指標間的相關系數(shù)

注：*、**分別表示0.05和0.01顯著水平

2.4 聚類分析

接種不同根瘤菌對草原3號雜花苜蓿幼苗生長起促進作用的指標有很多，對16個處理中的8個指標(株高、葉片數(shù)、葉寬、生物量、根長、根重、根瘤數(shù)、根瘤重)進行標準差標準化后，使用最長距離法聚為3類(圖3)。

第一類：顯著促進其幼苗生長的菌種為SJN、DZ、HK；第二類：各指標綜合作用較好的菌種為H7；第三類：其余菌種無明顯促進作用與CK聚為一類。

3 討論

3.1 接種不同根瘤菌對地上造成的影響

高振生等〔9〕試驗表明，接種根瘤菌可以提高植株生物學產量，但本試驗結果與其不一致。在接種同種根瘤的處理中，部分菌株在葉片數(shù)、株高、葉寬及地上生物量上并未與CK之間產生的差異，可能與本試驗采用無菌椰磚為基質有關，從而導致接種部分菌株的地上生物量與CK之間未產生差異；部分菌株作用可能表現(xiàn)在單一指標上，但在總體指標中未能發(fā)揮明顯效果。

3.2 接種不同根瘤菌對結瘤的影響

由于受試驗空間限制，未接種根瘤菌的植株長出根瘤菌，這與王作明等〔10〕研究結果一致。曾昭海等〔11〕研究，接種根瘤菌可提高植株幼苗時期的結瘤數(shù)，本試驗的結果不一致。部分菌株接種后并未與CK之間產生差異，可能菌株與草原3號雜花苜蓿匹配能力不同，因而未產生差異。龐丹波〔12〕試驗表明，接種根瘤菌可提高根瘤重量，本試驗結果與其不一致，可能因單播、無其它作物之間的相互作用，進而導致試驗結果有所差異。

在根瘤菌試驗中，大多數(shù)的試驗結果表明，根瘤菌數(shù)量是選擇最佳匹配組合的重要指標〔6,12-15〕，但本試驗結果也表明根瘤數(shù)與草原3號雜花苜蓿幼苗生長沒有顯著性，如HK結瘤數(shù)多，但生物量并沒顯著高于其它處理。這與潘佳等人〔1〕的試驗結果相同。本試驗結果表明根瘤重量與生物量之間存在顯著相關，這說明根瘤菌重量是影響生物量的重要指標之一，這與劉旭艷等人〔16,17〕的試驗結果相同。

3.3 接種不同根瘤菌根部的影響

本試驗結果表明，幼苗高度與根長之間存在極顯著相關，根長越長對土壤中的水分及養(yǎng)分吸收能力越強，對根瘤菌著生越有利，使其充分發(fā)揮作用，從而促進草原3號雜花苜蓿幼苗高度的生長。

3.4 根瘤菌結瘤影響

本試驗中菌株H7、DC3來源于不同地區(qū)相同的寄主植物草原3號雜花苜蓿，但同一材料的菌株可能分屬于兩個屬或同屬內親緣關系較遠，這與閆偉等〔8〕研究結果相同，這可能與土壤環(huán)境等條件的差異有關，進而造成根瘤菌侵染寄主植物的能力不同。

本試驗采用椰磚的試驗方法檢測根瘤菌與草原3號雜花苜蓿的匹配性，15株根瘤菌效果表現(xiàn)具有差異。這與管鳳貞等〔7〕研究結果是一致的。根瘤菌的有效性與多種因素有關。相關研究表明根瘤的形成與根瘤菌和寄主植物交換調節(jié)信號有關，根部分泌類黃酮物質才能誘導結瘤基因結瘤。本試驗所采用的培養(yǎng)基質椰磚，該基質可能是不能提供充足的微量元素來促進根瘤菌發(fā)揮其作用。

4 結論

從幼苗葉片數(shù)量、幼苗葉片寬以及幼苗的絕對高度、地上生物量以及根瘤的數(shù)量及其重量、根系長度及其重量均反映出，在15個苜?；ソ臃N族內的菌株中SJN、HK、DZ菌株接種草原3號雜花苜蓿的效果較好。