(菏澤市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 菏澤 274000)

腦卒中是一種由缺血或出血引起的急性腦功能紊亂性腦血管疾病，其中缺血性腦卒中是導(dǎo)致殘疾的首要因素，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前，對(duì)于腦卒中的處理方法主要有神經(jīng)保護(hù)和再灌注，但僅有再灌注以重組組織纖溶酶原激活劑和機(jī)械性破壞血栓在臨床試驗(yàn)中取得了成功[3-4]。因此，探索新的或更有效的治療策略是非常必要的。microRNAs(miRNAs)是一類長度約22 nt的單鏈核苷酸，結(jié)合到目標(biāo)mRNAs的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，致使翻譯抑制或mRNAs降解，從而參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控[5]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs在神經(jīng)發(fā)育和多種神經(jīng)疾病中有著重要作用。Rink等[6]的研究認(rèn)為，miRNAs在缺血性腦卒中的病因?qū)W和病理學(xué)方面已成為轉(zhuǎn)錄后基因沉默的關(guān)鍵介質(zhì)。miR-210表達(dá)抑制對(duì)中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)誘發(fā)的局灶性缺血性腦損傷有明顯的改善作用[7]。而miR-17-5p靶向目的基因?qū)Χ喾N疾病均有調(diào)節(jié)作用，其中也包括了對(duì)腦缺血缺氧性損傷的調(diào)節(jié)作用,然而miR-17-5p在其中的具體作用機(jī)制尚未見報(bào)道[8-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p在一些疾病中可通過靶向第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)發(fā)揮調(diào)控作用，推測miR-17-5p對(duì)腦缺血缺氧性損傷的調(diào)節(jié)可能與這一機(jī)制有關(guān)[11]。因此，本文采用線栓法建立MCAO大鼠模型，探討miR-17-5p對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(205.6±15.2)g，購自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；miR-17-5p模擬物(miR-17-5p mimic,mimic)、miR-17-5p抑制劑(miR-17-5p inhibitor,inhibitor)購自廣州銳博公司；BPV(phen抑制劑)購自上海默克公司；Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自美國ThermoFisher公司；蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒購自南京凱基生物有限公司；化學(xué)發(fā)光液、PVDF膜購自密理博中國有限公司；PTEN，蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin,mTOR)一抗、二抗購自Abcam公司；HE染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒購自美國EMD Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模與給藥 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(MCAO組)、MCAO+mimic組、MCAO+inhibitor組和MCAO+BPV組，每組12只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)。采用頸外動(dòng)脈插入線栓法建立MCAO模型[12-14]：大鼠麻醉后，仰臥固定，自頸部正中分離左頸總動(dòng)脈，結(jié)扎近心端，夾閉遠(yuǎn)心端，剪1個(gè)小口插入線栓并固定，松開動(dòng)脈夾，結(jié)扎后縫合肌肉和皮膚。Sham組只作頸部切開，分離后縫合，不作血管結(jié)扎處理。造模完成后MCAO+mimic組、MCAO+inhibitor組立即分別進(jìn)行尾靜脈注射50 nmol/kg miR-17-5p mimic、50 nmol/kg miR-17-5p inhibitor，每日1次，持續(xù)3 d。MCAO+BPV組建模前1 h尾靜脈注射100 μg/kg PTEN抑制劑BPV溶液，并在建模后每6 h腹腔注射1次200 μg/kg BPV溶液，持續(xù)24 h。Sham組和MCAO組大鼠給予等量的滅菌生理鹽水,在末次給藥后24 h進(jìn)行觀察。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 造模24 h后，參考Bederson法[15-16]對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：抓住大鼠尾部輕輕提起至超過平面10 cm，觀察各組大鼠行為并計(jì)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，未見活動(dòng)異常，大鼠被提尾懸空時(shí)前肢呈伸展?fàn)顟B(tài)，無神經(jīng)功能損傷；1分，大鼠被提尾懸空時(shí)，缺血半球?qū)?cè)腕、肘屈曲，肩內(nèi)收屈曲；2分，置大鼠于軟塑料板上，輕握鼠尾，在鼠肩后施加側(cè)向推力使鼠滑動(dòng)約10 cm，缺血半球?qū)?cè)的側(cè)向推動(dòng)阻力能力下降；3分，大鼠被提尾懸空時(shí)，缺血半球?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。其中0分為正常，1分為中度，2分及以上為重度。

1.2.3 腦組織含水量測定 對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后，斷頭處死大鼠，快速取出腦組織，用濾紙吸除表面多余水分后稱重，記為濕重；將腦組織放入110 ℃烘箱中24 h后稱重，記為干重。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.4 HE、TUNEL染色觀察腦組織病理損傷和細(xì)胞凋亡情況 取各組大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm。用HE染色和TUNEL染色試劑盒對(duì)腦組織切片進(jìn)行染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理學(xué)損傷和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡水平，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率為計(jì)數(shù)視野中凋亡細(xì)胞數(shù)目在總細(xì)胞數(shù)目中的百分比。

1.2.5 RT-PCR檢測miR-17-5p和PTEN的mRNA表達(dá)水平 取適量腦組織，用Trizol試劑提取各組大鼠腦組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行檢測。miR-17-5p引物：正向，CCA GGA TCC TTT ATA GTT GTT AGA GTT TG；反向，CGG AAT TCT AAT CTA CTT CAC TAT CTG CAC。PTEN引物：正向，TAG AGC GTG CAG ATA ATG AC；反向，GGC TCC TCT ACT GTT TTT GT。β-actin引物：正向，CAT CCT CAC CCT GAA GTA CCC；反向，AGC CTG GAT AGC AAC GTA CAT G。實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工設(shè)計(jì)合成，結(jié)果采用2法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 Western blot檢測通路蛋白表達(dá)磷酸化水平

在冰上操作，取適量腦組織，加入含蛋白抑制劑的裂解液，充分提取總蛋白。于4 ℃、12 000 r/min離心15 min后收集上清液進(jìn)行蛋白定量。加入緩沖液，煮沸使蛋白變性。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜。用5%的牛血清蛋白室溫封閉1 h。洗膜后加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h。洗膜后滴加發(fā)光液顯影，以β-actin為內(nèi)參。通過凝膠成像儀采集各組蛋白的灰度，分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-17-5p對(duì)MCAO大鼠腦組織含水量和神經(jīng)功能的影響

大鼠腦組織含水量和神經(jīng)功能檢測顯示，MCAO組大鼠腦組織含水量高于Sham組(圖1a)；2組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分均在2分以上(圖1b)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明MCAO組大鼠模型建立成功。MCAO+mimic組和MCAO+BPV組大鼠腦組織含水量、神經(jīng)功能評(píng)分低于MCAO組(圖1)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而MCAO+inhibitor組大鼠腦組織含水量、神經(jīng)功能評(píng)分則高于MCAO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

a:大鼠腦組織含水量；b:大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 *:與Sham組比較,P<0.05；#:與MCAO組比較，P<0.05

圖1 大鼠腦含水量和神經(jīng)功能評(píng)分

2.2 miR-17-5p對(duì)MCAO大鼠腦組織病理學(xué)改變的影響

HE染色觀察大鼠腦組織病理損傷發(fā)現(xiàn)，Sham組鏡下可見細(xì)胞排列規(guī)則、輪廓清晰，未見核濃染、空泡等病理改變；MCAO組則可見細(xì)胞排列紊亂、空泡化增加，細(xì)胞核深染，并發(fā)生核固縮，胞體溶解，細(xì)胞周圍的間隙擴(kuò)大，并呈彌漫性炎性浸潤；MCAO+inhibitor組細(xì)胞核皺縮濃染、空泡化，胞體溶解、間隙擴(kuò)大等病理改變更明顯；MCAO+mimic組和MCAO+BPV組腦組織病理學(xué)損傷明顯改善，見圖2。

2.3 miR-17-5p對(duì)MCAO大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色檢測大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯示，腦組織切片鏡下可見MCAO組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量多于Sham組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MCAO+mimic組和MCAO+BPV組棕色顆粒少于MCAO組，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于MCAO組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MCAO+inhibitor組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率高于MCAO組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖2 大鼠腦組織病理損傷情況

2.4 miR-17-5p和PTEN的靶向關(guān)系

采用TargetScan預(yù)測軟件預(yù)測miR-17-5p和PTEN的靶向關(guān)系發(fā)現(xiàn)，兩者在PTEN的3′UTR端存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，說明miR-17-5p和PTEN存在靶向關(guān)系(圖4a)。RT-PCR檢測兩者的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，MCAO組大鼠腦組織低表達(dá)miR-17-5p，高表達(dá)PTEN，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MCAO+mimic組和MCAO+BPV組miR-17-5p表達(dá)高于MCAO組，PTEN的mRNA表達(dá)量低于MCAO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MCAO+inhibitor組miR-17-5p表達(dá)低于MCAO組，PTEN的mRNA表達(dá)量高于MCAO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4b、c。

2.5 miR-17-5p靶向PTEN對(duì)MCAO大鼠腦組織中ATK/mTOR通路蛋白磷酸化的影響

Western blot檢測各組大鼠腦組織中通路蛋白磷酸化水平顯示，MCAO組大鼠腦組織中PTEN的表達(dá)水平高于Sham組，AKT和mTOR的磷酸化水平低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，MCAO+mimic組和MCAO+BPV組PTEN的表達(dá)水平低于MCAO組，AKT和mTOR的磷酸化水平高于MCAO組；MCAO+inhibitor組大鼠腦組織中PTEN表達(dá)水平高于MCAO組，AKT和mTOR磷酸化水平低于MCAO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

*：與Sham組比較，P<0.05；#：與MCAO組比較，P<0.05

a:miR-17-5p和PTEN靶向關(guān)系；b:腦組織中miR-17-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量;c:腦組織中PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量 *:與Sham組比較,P<0.05;#:與MCAO組比較,P<0.05

圖4 miR-17-5p和PTEN靶向關(guān)系

*：與Sham組比較，P<0.05；#：與MCAO組比較，P<0.05

3 討論

miRNAs在包括腦卒中在內(nèi)的許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中都起著重要作用[17-19]。miR-17是miR-17-92簇的成員之一，位于人類的13號(hào)染色體和小鼠14號(hào)染色體上，是第一組與發(fā)育綜合征相關(guān)的miRNAs群，對(duì)多種組織的發(fā)育意義重大[20]。在缺血缺氧性腦損傷疾病中，miR-17-5p具有緩解病癥的作用。Chen等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧性腦損傷模型中，miR-17-5p表達(dá)降低，上調(diào)miR-17-5p的表達(dá)抑制了NLRP3炎癥小體對(duì)腦組織的炎癥損傷和梗死發(fā)生。PTEN定位于染色體10q23.3,是由403個(gè)氨基酸組成的磷酸酯酶，是PI3K/Akt/mTOR中重要的負(fù)調(diào)控因子，PTEN可通過PIP3去磷酸化，拮抗Akt的功能[21]。Miao等[22]發(fā)現(xiàn)，在MCAO模型和氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)模型中，PTEN高表達(dá)促進(jìn)了神經(jīng)元細(xì)胞死亡。miR-17-5p對(duì)PTEN具有調(diào)控作用，Wu等[11]的研究表明，褐藻藻多糖可同時(shí)通過miR-29c/ADAM12和miR-17-5p/PTEN兩條途徑抑制乳腺癌細(xì)胞生長，推測miR-17-5p可直接或間接對(duì)PTEN進(jìn)行調(diào)控，從而對(duì)腦缺血缺氧性損傷產(chǎn)生影響。因此，本研究建立MCAO大鼠模型，探討miR-17-5p上調(diào)/下調(diào)對(duì)MCAO誘導(dǎo)的腦組織損傷的保護(hù)作用，及與PTEN表達(dá)水平和相關(guān)信號(hào)通路活化的關(guān)系。

本研究采用經(jīng)典的線栓法復(fù)制MCAO大鼠模型，并對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型建立顯著降低了大鼠的神經(jīng)功能，大鼠表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)癥狀；與此同時(shí)，大鼠腦組織水腫程度明顯增加，這與Wang等[23]建立的MCAO模型大鼠表現(xiàn)一致，證明MCAO模型建立成功。為了更為直觀地反應(yīng)MCAO大鼠的腦組織損傷，本研究對(duì)腦組織進(jìn)行了HE染色，證明MCAO模型建立誘導(dǎo)了腦組織神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生空泡化、炎癥浸潤等病理微結(jié)構(gòu)損傷，從結(jié)構(gòu)上闡明了MCAO大鼠神經(jīng)功能障礙的原因。而miR-17-5p過表達(dá)可有效減輕腦水腫、神經(jīng)功能損傷以及病理微結(jié)構(gòu)損傷，抑制miR-17-5p表達(dá)會(huì)加劇上述癥狀。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，MCAO模型建立誘導(dǎo)了大鼠腦組織結(jié)構(gòu)和功能上的損傷，miR-17-5p能有效改善腦組織的上述變化。

既往研究表明，很多miRNAs在MCAO模型中均表現(xiàn)出調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制多是通過靶向調(diào)節(jié)目的基因來實(shí)現(xiàn)[24-25]。為了進(jìn)一步研究miR-17-5p對(duì)MCAO大鼠腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用的分子機(jī)制，本文采用靶向關(guān)系預(yù)測軟件檢測發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p和PTEN存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，且在MCAO大鼠腦組織中miR-17-5p低表達(dá)，PTEN高表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在使用電針刺激法治療腦卒中時(shí)，PTEN通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白均受到調(diào)節(jié)，證明通過抑制PTEN能減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生率，從而對(duì)神經(jīng)功能發(fā)揮保護(hù)性作用[26]。本研究證明，在MCAO大鼠腦組織中，PTEN被miR-17-5p過表達(dá)明顯抑制，表明miR-17-5p可能通過抑制PTEN而對(duì)大鼠腦組織神經(jīng)功能發(fā)揮保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過miR-17-5p靶向抑制PTEN能夠有效提高AKT和mTOR磷酸化水平，從而激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路；通過miR-17-5p抑制劑抑制miR-17-5p的表達(dá)可阻斷AKT/mTOR信號(hào)通路激活。AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞增殖、生長、凋亡的關(guān)鍵通路，AKT通過磷酸化活化，進(jìn)而對(duì)下游的各種酶、轉(zhuǎn)錄因子等的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)；mTOR是AKT下游的一種對(duì)細(xì)胞生長和增殖過程至關(guān)重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶[27]。Mao等[28]發(fā)現(xiàn)，在MCAO模型建立之后的14 d內(nèi)，PTEN在腦組織中仍保持高表達(dá)，PTEN特異性抑制劑BPV可激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路，從而促進(jìn)OGD/R模型細(xì)胞的軸突生長，提示PTEN在缺血性腦組織中通過阻斷AKT/mTOR信號(hào)通路激活而抑制軸突再生。本研究證明，miR-17-5p過表達(dá)能通過靶向抑制PTEN而促進(jìn)AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，并減輕MCAO大鼠腦組織損傷和減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，對(duì)腦組織缺血性損傷起到保護(hù)作用，但其中是否還存在其他病理/生理過程的改變(如自噬程度)或其他信號(hào)通路的參與還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究表明，在MCAO大鼠模型中，miR-17-5p低表達(dá)，PTEN高表達(dá)，兩者存在靶向關(guān)系；mimic上調(diào)miR-17-5p表達(dá)后，大鼠神經(jīng)功能、腦水腫、腦組織神經(jīng)元細(xì)胞空泡化等病理改變和細(xì)胞凋亡率均得到明顯改善；miR-17-5p對(duì)MCAO大鼠腦組織病理損傷和凋亡抑制的作用與靶向抑制PTEN表達(dá)并促進(jìn)AKT/mTOR信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究旨在為腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性疾病的治療提供試驗(yàn)依據(jù)，下一步計(jì)劃研究miR-17-5p和其他靶基因?qū)CAO模型腦損傷的保護(hù)作用。