(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,重慶 400038)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種經(jīng)典的抗炎免疫因子，可由上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，在感染性疾病、自身免疫性疾病、特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1-4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，并經(jīng)自分泌的方式作用于腫瘤細(xì)胞，直接促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，或者通過(guò)旁分泌的方式抑制抗腫瘤免疫細(xì)胞的功能，有利于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[5-6]。據(jù)研究報(bào)道，腫瘤中TGF-β1的信號(hào)與淋巴管的密度以及促淋巴管生成標(biāo)志物血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)的表達(dá)密切相關(guān)，提示腫瘤細(xì)胞來(lái)源的TGF-β1很可能參與調(diào)控淋巴管的形成，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移[7]。在胃癌微環(huán)境中，TGF-β1以及VEGF-C的水平均顯著增加，然而，腫瘤來(lái)源的TGF-β1能否誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞分泌VEGF-C以及相關(guān)的分子機(jī)制尚不清楚[8-9]。因此，本研究擬體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS并利用TGF-β1進(jìn)行刺激，檢測(cè)VEGF-C的分泌水平，進(jìn)一步闡明其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

重組細(xì)胞因子TGF-β1購(gòu)自加拿大Stem cell公司，TGF-βR抑制劑(SB-431542)、Smad3抑制劑(SIS3)、NF-κB抑制劑(BAY11-7082)、MEK1/2抑制劑(U0126)、p38/MAPK抑制劑(SB203580)和JNK抑制劑(SP600125)購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，APC標(biāo)記的抗人TGF-β受體Ⅱ (TGF-β receptor Ⅱ,TGF-βRⅡ)染色抗體、同型對(duì)照染色抗體、細(xì)胞固定/裂解液、細(xì)胞通透/清洗液購(gòu)自美國(guó)BD公司。VEGF-C酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、4%多聚甲醛及PBS均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

AGS細(xì)胞用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的AGS細(xì)胞以2×106個(gè)/孔鋪于6孔板中，然后加入0、10、100 ng/mL的TGF-β1進(jìn)行培養(yǎng)，或預(yù)先加入濃度均為10 μmol/LTGF-βR抑制劑(SB-431542)、Smad3抑制劑(SIS3)、NF-κB抑制劑(BAY11-7082)、MEK1/2抑制劑(U0126)、p38/MAPK抑制劑(SB203580)和JNK抑制劑(SP600125)孵育1 h，然后清洗孔中的培養(yǎng)基，再加入新的培養(yǎng)基后利用TGF-β1刺激24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并凍存于-80 ℃，用ELISA檢測(cè)上清液中的VEGF-C水平。細(xì)胞處理分組如下：未刺激組和TGF-β1刺激組用于比較TGF-β1對(duì)細(xì)胞分泌VEGF-C的影響；TGF-β1刺激下的TGF-βR抑制劑組用于分析TGF-β受體阻斷后對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞分泌VEGF-C的影響；此外，均有TGF-β1刺激的DMSO組、Smad3抑制劑組、NF-κB抑制劑組、MEK1/2抑制劑組、p38/MAPK抑制劑組以及JNK抑制劑組用于比較不同信號(hào)通路阻斷后對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞分泌VEGF-C的影響，其中DMSO組是其他信號(hào)抑制劑組的對(duì)照組。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)

AGS細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激后使用胰酶消化，并用無(wú)菌PBS清洗2次，然后加入APC標(biāo)記的抗人TGF-βRⅡ染色抗體及相應(yīng)的同型對(duì)照染色抗體，避光染色30 min后用4%多聚甲醛固定15 min，隨后用PBS清洗2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)AGS細(xì)胞表達(dá)TGF-βRⅡ的情況。

1.4 VEGF-C檢測(cè)

參照VEGF-C的ELISA檢測(cè)試劑盒操作指南，檢測(cè)不同處理組間AGS細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF-C水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TGF-β受體在AGS細(xì)胞的表達(dá)

TGF-β1的受體由細(xì)胞膜表面的TGF-βRⅡ以及胞內(nèi)的TGF-βRⅠ組成。利用熒光標(biāo)記的TGF-βRⅡ抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示，與未染色的AGS細(xì)胞相比，同型對(duì)照抗體染色的AGS細(xì)胞未見(jiàn)峰值的右移，而經(jīng)APC標(biāo)記的TGF-βRⅡ陽(yáng)性抗體染色的細(xì)胞峰值則明顯右移，由此表明AGS細(xì)胞可高表達(dá)TGF-β1的受體TGF-βR(圖1)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)染色檢測(cè)TGF-β1受體在AGS細(xì)胞的表達(dá)水平

2.2 TGF-β1誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌VEGF-C

體外培養(yǎng)的AGS細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激后，收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液進(jìn)行分析。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，TGF-β1刺激組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C的含量顯著高于未刺激組(P<0.05或P<0.01)；AGS細(xì)胞經(jīng)TGF-β1以0、1、10、100 ng/mL的劑量刺激24 h后，其上清液中VEGF-C水平分別為(34.4±10.4)pg/mL、(138.5±22.7)pg/mL、(421.3±28.2)pg/mL、(735.2±35.1)pg/mL，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；此外，進(jìn)一步利用10 ng/mL的TGF-β1刺激AGS細(xì)胞，并于12、24、48 h后分別檢測(cè)VEGF-C的分泌水平，結(jié)果顯示，隨著TGF-β1刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，AGS細(xì)胞分泌的VEGF-C水平逐漸增加(圖2)，由此表明TGF-β1能夠誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌VEGF-C，并具有劑量和時(shí)間依賴性。

a： TGF-β1在不同濃度下(0、1、10、100 ng/mL)誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌的VEGF-C水平；b： TGF-β1(10 ng/mL)在不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌的VEGF-C水平 *：P<0.05；#：P<0.01

圖2 TGF-β1誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌VEGF-C的水平比較

2.3 TGF-β1通過(guò)TGF-βR-Smad3信號(hào)誘導(dǎo)VEGF-C的分泌

鑒于TGF-β1可誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌VEGF-C，本本研究進(jìn)一步探討其可能的分子調(diào)控機(jī)制，結(jié)果顯示，在TGF-β1刺激24 h的前提下，AGS細(xì)胞分泌的VEGF-C水平為(438.3±25.1)pg/mL，但是當(dāng)利用TGF-β受體的抑制劑SB-431542阻斷TGF-β1與受體的結(jié)合后，VEGF-C水平僅為(49.4±16.3)pg/mL，二者差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外，利用Smad3抑制劑(SIS3)、NF-κB抑制劑(BAY11-7082)、MEK1/2抑制劑(U0126)、p38/MAPK抑制劑(SB203580)和JNK抑制劑(SP600125)預(yù)處理1 h，隨后再利用TGF-β1進(jìn)行刺激，結(jié)果顯示，與TGF-β1刺激下的DMSO組相比，TGF-β1刺激下的Smad3抑制劑組中VEGF-C的水平顯著下降，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。在TGF-β1刺激下，NF-κB抑制劑組、MEK1/2抑制劑組、p38/MAPK抑制劑組及JNK抑制劑組中AGS細(xì)胞分泌的VEGF-C水平與DMSO組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示TGF-β1通過(guò)TGF-β受體及下游Smad3信號(hào)途徑誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌VEGF-C。

a：TGF-βR抑制劑SB-431542對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)AGS分泌VEGF-C的影響；b：不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)AGS分泌VEGF-C的影響 #：P<0.01

圖3 不同信號(hào)抑制劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌VEGF-C的影響

3 討論

胃癌作為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和致死率[10]。盡管手術(shù)切除、放療、化療以及靶向免疫治療在早期胃癌患者中取得了較好的效果，但對(duì)晚期胃癌轉(zhuǎn)移患者的療效仍十分有限[11]?，F(xiàn)有的研究證據(jù)顯示，不健康飲食、細(xì)菌感染以及基因等是胃癌的致病因素，而腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，特別是調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答則在胃癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[[12-14]。因此，深入闡明腫瘤微環(huán)境中促胃癌轉(zhuǎn)移的免疫學(xué)機(jī)制可為疾病的治療提供理論依據(jù)。

已有多個(gè)研究證實(shí)調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子TGF-β1是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，患者的腫瘤細(xì)胞及腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞高表達(dá)TGF-β1，并證實(shí)TGF-β1的表達(dá)水平與患者的疾病進(jìn)展和不良預(yù)后呈顯著正相關(guān)[15]。腫瘤微環(huán)境中TGF-β1的功能實(shí)現(xiàn)依賴于其相應(yīng)的受體TGF-βR。早期研究證實(shí)，胃癌原代細(xì)胞可高表達(dá)TGF-βR，繼而調(diào)控TGF-β1的下游級(jí)聯(lián)信號(hào)[16]；然而胃癌組織中的原代細(xì)胞常難以分離純化及大規(guī)模體外培養(yǎng)，極大地限制了TGF-β1的生物學(xué)功能研究。為了探討TGF-β1對(duì)胃癌細(xì)胞的影響，本研究首先分析了體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞是否表達(dá)其相應(yīng)的受體。流式細(xì)胞術(shù)顯示，經(jīng)抗體染色的AGS細(xì)胞顯示出強(qiáng)的熒光，表明大量的熒光標(biāo)記抗體在AGS細(xì)胞表面結(jié)合，有效證實(shí)了AGS細(xì)胞高表達(dá)TGF-βR，并提示AGS細(xì)胞可作為體外研究TGF-β1功能的靶細(xì)胞。

TGF-β1結(jié)合受體后，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌促轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TGF-β1刺激的AGS細(xì)胞可大量分泌促淋巴管生成因子VEGF-C；隨著TGF-β1刺激劑量或者刺激時(shí)間的增加，其誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌VEGF-C的水平也逐漸增加。當(dāng)加入TGF-βR抑制劑阻斷TGF-β1與其受體的相互作用后，AGS細(xì)胞分泌的VEGF-C水平明顯下降，由此提示TGF-β1通過(guò)其受體調(diào)控了VEGF-C的體外分泌。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1刺激組細(xì)胞表達(dá)的VEGF-C mRNA水平顯著高于未刺激組，而經(jīng)TGF-βR受體抑制劑阻斷后，TGF-β1誘導(dǎo)的VEGF-C mRNA水平則顯著下降[18]，由此提示TGF-β1很可能通過(guò)調(diào)控VEGF-C的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響其在體外的分泌。

TGF-β1與TGF-βR結(jié)合后，需要激活下游的級(jí)聯(lián)信號(hào)，才能誘導(dǎo)VEGF-C的有效分泌。目前，已有研究報(bào)道Smad3、NF-κB和MAPK等多條信號(hào)通路參與介導(dǎo)TGF-β1的生物學(xué)功能[19-20]。因此，本研究加入多個(gè)信號(hào)通路抑制劑，以期探討TGF-β1誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌VEGF-C的分子機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在均有TGF-β1作用的條件下，預(yù)先加入Smad3抑制劑(SIS3)的AGS細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C水平顯著低于加入DMSO的AGS細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C的水平，而NF-κB抑制劑BAY11-7082、MEK1/2抑制劑(U0126)、p38/MAPK抑制劑(SB203580)和JNK抑制劑(SP600125)處理的AGS細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C的水平與DMSO組中VEGF-C的水平相當(dāng)，由此表明在體外培養(yǎng)的AGS細(xì)胞中，TGF-β1經(jīng)TGF-βR-Smad3信號(hào)通路誘導(dǎo)VEGF-C的分泌?；赩EGF-C參與誘導(dǎo)新生淋巴管的形成并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移，由此提示在胃癌微環(huán)境中，TGF-β1可能通過(guò)增加VEGF-C的分泌參與調(diào)控腫瘤淋巴管的形成，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TGF-β1可通過(guò)TGF-βR及其下游Smad3信號(hào)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞分泌VEGF-C，進(jìn)而有助于胃癌研究的不斷進(jìn)展，是探討TGF-β1在胃癌生物學(xué)作用中的有力補(bǔ)充，揭示了TGF-β1不僅能夠直接促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化后的遠(yuǎn)端播散，而且還可以通過(guò)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞分泌促淋巴管生成因子VEGF-C，協(xié)助胃癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。因此，進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)研究闡明TGF-β1調(diào)控VEGF-C分泌的促瘤機(jī)制，將為臨床胃癌患者靶向設(shè)計(jì)阻斷TGF-β1及其下游信號(hào)的免疫治療方案提供新的理論依據(jù)。