李 陽 施亞坤 高士科 李曉嶼 藍(lán)興國(guó)

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDIs)及其類蛋白(PDILs)是硫氧還蛋白超家族的成員,不僅具有催化蛋白質(zhì)二硫鍵氧化、還原和異構(gòu)的功能，而且還具有分子伴侶活性和參與新陳代謝的功能[1～5]。典型的PDI由5個(gè)結(jié)構(gòu)域(a,b,b’,a’,c)以及一個(gè)N端信號(hào)肽和C端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)(KDEL)組成。其中a型結(jié)構(gòu)域(a和a’區(qū))與硫氧還蛋白(Trx)家族具有同源性，分別包含一個(gè)氧化還原活性位點(diǎn)-CGHC-,能催化蛋白質(zhì)二硫鍵的氧化與還原[6]；b型結(jié)構(gòu)域(b和b’區(qū))二級(jí)結(jié)構(gòu)與a型相似，具有異構(gòu)酶的活性和與底物結(jié)合的能力；c區(qū)的C末端富含酸性氨基酸，是Ca2+結(jié)合區(qū)域并具有異構(gòu)酶的活性[7～8]。

PDILs主要是由a型和b型同源結(jié)構(gòu)域以不同的排列方式組合而成。PDILs目前主要分為6簇，1簇除典型結(jié)構(gòu)域(a,b,b’,a’,c)外還含有N末端酸性結(jié)構(gòu)域；2簇為真菌PDI，含a，a’或a，b，a’結(jié)構(gòu)域；植物的PDI大多在3簇，含有典型的5個(gè)結(jié)構(gòu)域(a,b,b’,a’,c)；4簇僅有a結(jié)構(gòu)域；5簇中的PDI含有與典型結(jié)構(gòu)域不同的D結(jié)構(gòu)域；大部分動(dòng)物的PDI屬于6簇，含有a,b,b’,a’結(jié)構(gòu)域[3]。它們多數(shù)具有催化蛋白質(zhì)二硫鍵氧化還原的功能和分子伴侶活性，其間差異可能體現(xiàn)在底物的結(jié)合能力和組織特異性、表達(dá)水平和調(diào)控模式上[9～10]。

目前，在動(dòng)物和真菌中的研究發(fā)現(xiàn)，PDI和PDILs不僅與癌癥、精卵細(xì)胞的融合有關(guān)[11～12]，而且在細(xì)胞穩(wěn)定、離子吸收、基因活化和細(xì)胞分化等方面具有重要的作用[13]。在植物研究中，從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysL.)等克隆了一些PDIs和PDILs[14～19]。擬南芥中的PDILs有12種，其中AtPDIL1的表達(dá)能夠提高脅迫條件下種子的萌發(fā)和幼苗根的生長(zhǎng)[20]。水稻中的PDILs有12種，其中OsPDIL1-1參與胚乳內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上谷蛋白和醇溶蛋白的成熟過程[21～22]，它的缺失導(dǎo)致水稻粉狀淀粉的形成和對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的響應(yīng)[18]。小麥中的PDILs蛋白有9種，它們與面筋蛋白的合成有關(guān)[23]。玉米中的PDILs蛋白有12種，它們受干旱、冷、ABA和鹽等逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[13]。甘薯中分離出了PDIL的cDNA，其中SPPDI1具有脫氫抗壞血酸還原酶活性和單脫氫抗壞血酸還原酶活性[24]。胡蘿卜中分離出了PDI，可催化胰島素中二硫鍵的氧化還原和變性RNase A的復(fù)性[25]。

目前植物PDILs的生物學(xué)功能研究主要集中在種子萌發(fā)調(diào)控及逆境響應(yīng)等方面，然而在其他方面的功能仍亟待研究[26～27]。在本研究中將羽衣甘藍(lán)自交不親和系(S13-bS13-b)作為研究材料，利用RT-PCR和RACE方法分離羽衣甘藍(lán)PDIL1-2基因并進(jìn)行序列分析，通過原核表達(dá)純化系統(tǒng)獲得BoPDIL1-2的融合蛋白，并制備多克隆抗體和免疫印跡分析BoPDIL1-2組織表達(dá)模式以及在柱頭發(fā)育過程中的表達(dá)情況，從而為深入研究BoPDIL1-2的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

于2017年6月在東北林業(yè)大學(xué)花卉生物工程研究所種植羽衣甘藍(lán)自交不親和系(S13-bS13-b)。在2018年2月～4月開花期間，采集當(dāng)天開花的花蕾和莖、葉，用鑷子分別剝?nèi)』ㄖ?、花瓣、柱頭、子房和花藥，選取不同花蕾長(zhǎng)度(S1-S5)的柱頭為不同發(fā)育時(shí)期材料，用液氮速凍后，存于-80℃冰箱備用[28]。

1.2 羽衣甘藍(lán)PDIL1-2全長(zhǎng)cDNA的分離

利用CTAB法從羽衣甘藍(lán)柱頭中提取總RNA[29]。使用DnaseⅠ酶(RNase free)消化后的柱頭總RNA作為模板，采用錨定引物Oligo(dT)18和AMV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，程序?yàn)椋?2℃孵育30 min，99℃變性5 min，4℃孵育5 min。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)發(fā)表甘藍(lán)PDIL1-2基因的5′和3′末端序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物PDIL1-2-RT-For和PDIL1-2-RT-Rev(表1),模板為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的第1條鏈，使用LA taq DNA聚合酶(TaKaRa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，進(jìn)行35次循環(huán)后，72℃延伸7 min。用E.Z.N.A.TMGel Extract kit對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收后與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化到Top10菌株中，用藍(lán)白斑篩選法挑選陽性克隆并檢測(cè)核酸序列。

根據(jù)所得的PDIL1-2的cDNA(BoPDIL1-2)序列，分別設(shè)計(jì)5′RACE的特異性引物PDIL1-2-SP1和PDIL1-2-SP2，及3′RACE的特異性引物PDIL1-2-SP5(表1),按照RACE試劑盒Roche 5′/3′ RACE Kit，2ndGeneration說明書進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增。利用試劑盒引物Oligo(dT)-Anchor primer和PCR Anchor primer，采用嵌套PCR和Touchdown PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將得到的5′末端序列和3′末端序列以及中間序列拼接，得到cDNA的全長(zhǎng)序列，利用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，并用在線網(wǎng)站ProtParam(http://www.expasy.org)預(yù)測(cè)編碼蛋白的分子量、保守結(jié)構(gòu)域及理論等電點(diǎn)等。

1.3 羽衣甘藍(lán)PDIL1-2的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備

1.3.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-14b-BoPDIL1-2的構(gòu)建

引物PDIL1-2-pET-For(5′-GACGGTACCATGGCGTCTAACGGCTTCGC-3′)，下劃線代表KpnⅠ酶切位點(diǎn)；PDIL1-2-pET-Rev(5′-GACGGATCCCTACAGCTCGTCCTTCGCGG-3′)，下劃線代表BamHⅠ酶切位點(diǎn)。以PDIL1-2的cDNA(BoPDIL1-2)編碼序列為模板，利用KOD高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94℃變性15 s，55℃退火30 s，68℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化和雙酶切后，插入pET-14b載體中。將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，進(jìn)行核酸序列分析。

表1 羽衣甘藍(lán)BoPDIL1-2基因克隆及原核表達(dá)分析所用引物

1.3.2 BoPDIL1-2重組蛋白質(zhì)的原核表達(dá)

經(jīng)鑒定后正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中。在5 mL LB培養(yǎng)基中加入單菌落，于37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期A600=0.6，加入終濃度為1 mmol·L-1的異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導(dǎo)4 h后進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后對(duì)其表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 BoPDIL1-2融合蛋白的純化及多克隆抗體制備

大量擴(kuò)增誘導(dǎo)并收集細(xì)菌；用5 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)菌沉淀(30 mmol·L-1NaCl；10 mmol·L-1咪唑；20 mmol·L-1Tris-base；pH 8.0)，細(xì)菌經(jīng)超聲破碎后，12 000 r·min-1、4℃離心15 min。Poly-Prep chromatography column層析柱被結(jié)合緩沖液平衡后，加上清，并向其中加入100 μL Ni2+-NTA瓊脂糖(Novagen公司)，4℃結(jié)合30 min后，依次用20、30和40 mmol·L-1咪唑洗脫緩沖液對(duì)Ni2+-NTA瓊脂糖進(jìn)行洗脫，最后用250 mmol·L-1咪唑洗脫并收集融合蛋白。過濾含有目的蛋白的洗脫液Amicon? Ultra-4(3 kD截流，Millipore公司)，然后用PBS緩沖液(2.68 mmol·L-1KCl，1.46 mmol·L-1KH2PO4，137 mmol·L-1NaCl，8.1 mmol·L-1Na2HPO4，pH7.4)進(jìn)行透析。利用獲得的重組BoPDIL1-2融合蛋白免疫小鼠，制備BoPDIL1-2多克隆抗體，具體方法參考Li等[30]。

1.4 BoPDIL1-2在不同組織及柱頭不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

采集羽衣甘藍(lán)莖、葉、花柱、花瓣、子房、柱頭、花藥，以及花蕾大小在S1(0～4.0 mm)、S2(4.1～6.0mm)、S3(6.1～8.0 mm)、S4(8.1～10.0 mm)和S5(>10.1 mm)時(shí)的柱頭，總蛋白提取及蛋白定量參照Lan等的方法[26]。

1.5 免疫印跡

取已經(jīng)定量的蛋白樣品各10 μg，進(jìn)行12%的SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Amersham Biosciences)中。在室溫下，用含有5%牛血清白蛋白(BIOSHARP)的TBST(137 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1Tris base，0.1% Tween-20)封閉1 h。一抗為Anti-BoPDIL1-2，稀釋倍數(shù)為1∶2 000。二抗為山羊抗鼠抗體，其上偶聯(lián)有辣根過氧化物酶，稀釋倍數(shù)為1∶5 000。經(jīng)一抗、二抗結(jié)合后，把LumiGLO混合液(Cell Signaling Technology)均勻地滴在PVDF膜上，用Kodak IS2000R進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羽衣甘藍(lán)PDIL1-2基因的克隆、序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

用羽衣甘藍(lán)柱頭總RNA作為模板，以RT-PCR法獲得長(zhǎng)度為1 545 bp的cDNA序列。然后分別通過5′RACE和3′RACE的方法獲得長(zhǎng)度為415 bp的5′末端序列和341 bp的3′末端序列。將cDNA序列和5′末端序列以及3′末端序列進(jìn)行拼接，獲得了一個(gè)1 689 bp的全長(zhǎng)cDNA序列，將其命名為BoPDIL1-2，GenBank登錄號(hào)為MK241691。BoPDIL1-2的全長(zhǎng)cDNA含有一個(gè)1 530 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，對(duì)應(yīng)編碼一個(gè)含509個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，52 bp的5′非翻譯區(qū)和107 bp的3′非翻譯區(qū)(圖1)。BoPDIL1-2的理論等電點(diǎn)(pI)為5.00，相對(duì)分子質(zhì)量約為55.7 kD。氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果表明，BoPDIL1-2與油菜BnPDIL1-2具有97.3%的一致性，與擬南芥AtPDIL1-2具有85.5%的一致性(圖2)。

蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，BoPDIL1-2蛋白由一個(gè)N端的信號(hào)肽(SP)、中間4個(gè)結(jié)構(gòu)域(a,b,b’,a’)和C末端攜帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽KDEL組成(圖3)。a和a’區(qū)與硫氧還蛋白(Trx)家族有同源性，都包括一個(gè)氧化還原活性位點(diǎn)-CGHC-；b和b’區(qū)和硫氧還蛋白沒有同源性，但其二級(jí)結(jié)構(gòu)同a或a’相似。

2.2 羽衣甘藍(lán)PDIL1-2原核表達(dá)分析

利用PCR方法擴(kuò)增PDIL1-2的編碼序列，通過雙酶切消化構(gòu)建到pET-14b載體上，通過測(cè)序確定構(gòu)建了pET-14b-BoPDIL1-2表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建好的pET-14b-BoPDIL1-2表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS菌株中。在37℃下用IPTG誘導(dǎo)4 h，裂解細(xì)菌。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液蛋白中，有一條58 kDa左右的蛋白條帶被特異性地誘導(dǎo)出來(圖4)。由于考慮到表達(dá)載體表達(dá)His6標(biāo)簽等氨基酸的分子量，因此認(rèn)為這個(gè)誘導(dǎo)58 kDa的蛋白與預(yù)測(cè)重組蛋白質(zhì)的分子量相符。大量擴(kuò)增表達(dá)菌液后，利用超生方法破碎細(xì)胞，通過Ni2+-NTA親合樹脂純化后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。從圖4中的結(jié)果顯示出，重組蛋白質(zhì)(His6-BoPDIL1-2)純化出來，而且蛋白的純度較高。利用純化的重組蛋白免疫小鼠，制備BoPDIL1-2的多克隆抗體。

圖1 羽衣甘藍(lán)BoPDIL1-2全長(zhǎng)cDNA核苷酸序列及其推測(cè)的氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA nucleotide sequence of BoPDIL1-2 and its putative amino acidsequence

圖2 羽衣甘藍(lán)BoPDIL1-2與油菜BnPDIL1-2、擬南芥AtPDIL1-2氨基酸序列比對(duì) 彩色背景為不一致的氨基酸序列。Fig.2 Alignment of predicted amino acid sequences among BoPDIL1-2,Brassica napus BnPDIL1-2 and Arabidopsis thaliana AtPDIL1-2 Colorful background are different residues.

圖3 羽衣甘藍(lán)BoPDIL1-2蛋白的結(jié)構(gòu)域 SP.信號(hào)肽；KDEL.賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸四肽序列,為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)；a、b、a’、b’為羽衣甘藍(lán)PDIL1-2的四個(gè)結(jié)構(gòu)域(a和a’區(qū)與硫氧還蛋白(Trx)家族同源；b和b’區(qū)和硫氧還蛋白不同源)Fig.3 The protein domain of BoPDIL1-2 SP.Signal peptide; KDEL.Lysine-aspartic acid-glutamic acid-leucine,a signal for endoplasmic reticulum retention; a,b,a’,b’ are the four domains of Ornamental Kale of PDIL1-2(a and a’ regions are homologous to the thioredoxin(Trx) family; b and b’ regions are different from Trx )

圖4 BoPDIL1-2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化 1.誘導(dǎo)前細(xì)菌蛋白；2.誘導(dǎo)后細(xì)菌蛋白；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；3.純化的目的蛋白Fig.4 Induction and purification of recombination BoPDIL1-2 1.Bacteria protein before IPTG induction；2.Bacteria protein after IPTG induction；M.Protein marker; 3.Purification of target protein

圖5 免疫印跡分析BoPDIL1-2在植物各組織中的表達(dá)水平Fig.5 Western blot analysis of BoPDIL1-2 expression levels in various tissue

圖6 免疫印跡分析BoPDIL1-2在柱頭發(fā)育過程中的表達(dá)水平Fig.6 Western blot analysis of BoPDIL1-2 expression levels in the different developmental stigma

2.3 免疫印跡分析BoPDIL1-2在各組織和柱頭發(fā)育中的表達(dá)水平

為了分析BoPDIL1-2在植物組織中的表達(dá)水平，分別提取莖、葉、花瓣、柱頭、花柱、子房和花藥的總蛋白。利用制備的BoPDIL1-2多克隆抗體，通過免疫印記的方法檢測(cè)BoPDIL1-2的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的各組織中，在56 kD處有特異性條帶出現(xiàn)，這與預(yù)測(cè)的BoPDIL1-2大小相近；BoPDIL1-2在柱頭中的表達(dá)量最高，在莖、葉、花瓣、花柱、子房和花藥表達(dá)量較低(圖5)。這個(gè)結(jié)果說明在檢測(cè)的組織樣品中，BoPDIL1-2特異性地在柱頭中表達(dá)。

為了進(jìn)一步分析BoPDIL1-2在不同發(fā)育階段柱頭的表達(dá)情況，提取了S1到S5階段的柱頭總蛋白。免疫印記的結(jié)果顯示，在柱頭發(fā)育的早期階段S1階段，BoPDIL1-2的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到；到S2階段，BoPDIL1-2表達(dá)量逐漸升高；從S3到S5階段柱頭表達(dá)量較高(圖6)。這個(gè)結(jié)果表明BoPDIL1-2表達(dá)與柱頭發(fā)育密切相關(guān)，可能在柱頭發(fā)育過程中具有重要的作用。

3 討論

本研究從羽衣甘藍(lán)自交不親和系(S13-bS13-b)中分離出BoPDIL1-2基因。它的全長(zhǎng)cDNA序列為1 689 bp，包含52 bp的5′非翻譯區(qū)、107 bp的3′非翻譯區(qū)和1 530 bp的開放閱讀框，對(duì)應(yīng)編碼一個(gè)含509個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BoPDIL1-2蛋白由一個(gè)N端的信號(hào)肽(SP)、中間4個(gè)結(jié)構(gòu)域(a,b,b’,a’)和C末端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽KDEL組成；它屬于Meiri等規(guī)定的第三簇。a和a’區(qū)與硫氧還蛋白(Trx)家族同源有同源性，都包括一個(gè)氧化還原活性位點(diǎn)；b和b’區(qū)和硫氧還蛋白家族沒有同源性,但其二級(jí)結(jié)構(gòu)同a或a’相似。這說明BoPDIL1-2的活性與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶相似，都具有催化蛋白質(zhì)二硫鍵氧化、還原和異構(gòu)的功能，此外，還可能有其他的生物學(xué)功能。氨基酸序列比對(duì)分析顯示，BoPDIL1-2與油菜BnPDIL1-2具有97.3%的一致性，與擬南芥AtPDIL1-2具有85.5%的一致性，這暗示這個(gè)蛋白在進(jìn)化過程中是保守的。此外，利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行BoPDIL1-2融合蛋白的表達(dá)純化。在原核表達(dá)分析中，58kD處發(fā)現(xiàn)了被誘導(dǎo)出來的蛋白，其分子量與預(yù)測(cè)的融合蛋白相符；在純化的過程中并未形成包涵體，因此利用Ni2+-NTA樹脂通過親和層析的方法獲得高純度的BoPDIL1-2融合蛋白。

在免疫印跡中，BoPDIL1-2蛋白在柱頭組織中表達(dá)量最高，在莖、葉、花瓣、花柱、子房和花藥表達(dá)量較低；這與擬南芥中PDIs在花和未成熟種子中表達(dá)量較高具有一定的相似性[6,30]；這也暗示了BoPDIL1-2可能特異性地參與柱頭的生物學(xué)功能。在羽衣甘藍(lán)柱頭的不同發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)，BoPDIL1-2在S1階段幾乎不表達(dá)；從S2階段開始BoPDIL1-2的表達(dá)量逐漸升高；在S3到S5階段BoPDIL1-2的表達(dá)量較高。這個(gè)結(jié)果表明BoPDIL1-2的表達(dá)與柱頭發(fā)育密切相關(guān)，暗示了BoPDIL1-2可能在柱頭發(fā)育過程中具有重要的作用。

本試驗(yàn)通過對(duì)羽衣甘藍(lán)BoPDI1-2基因進(jìn)行克隆，對(duì)其進(jìn)行序列及結(jié)構(gòu)域的分析，豐富了對(duì)蕓苔屬植物PDIL1-2基因的認(rèn)識(shí)。并通過對(duì)該基因在組織、柱頭發(fā)育的表達(dá)量分析，認(rèn)為BoPDIL1-2可能在柱頭發(fā)育過程中起到重要的作用，這對(duì)羽衣甘藍(lán)的培育和推廣具有重要價(jià)值和意義，也為探討植物中PDI的生物學(xué)功能提供了重要線索；但其具體作用機(jī)制仍不明確，在后續(xù)研究中我們將繼續(xù)對(duì)BoPDIL1-2基因在羽衣甘藍(lán)柱頭發(fā)育過程的具體功能和作用機(jī)制進(jìn)行分析。