李亞博 呂佳欣 譚 冰 高彩球

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。根據(jù)半胱氨酸(C)和組氨酸(H)殘基的數(shù)目和位置可以將鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子分為C2H2、C4、C6、C8、C3HC4、C2HC、C2HC5、C4HC3、CCCH等9種不同類型。其中C2H2型鋅指蛋白是數(shù)量最多、研究最為清楚的一類鋅指蛋白，該類鋅指蛋白大部分在鋅指區(qū)具有植物中特有的“QALGGH”保守結(jié)構(gòu)，可能涉及調(diào)控植物特有的生物學(xué)功能[1]。鋅指區(qū)通過與靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特異性結(jié)合，以及與自身或其他鋅指蛋白的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)[2～4]。

ZFP轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物過程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和形態(tài)發(fā)生以及生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)。例如，一些植物ZFP轉(zhuǎn)錄因子與光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[5]。擬南芥AtATL15基因顯示出響應(yīng)抗壞血酸(AsA)并在植物生長調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[6]。在辣椒中，CaRZFP1是可以被熱誘導(dǎo)的C3HC4型ZFP家族轉(zhuǎn)錄因子，通過誘導(dǎo)其表達(dá)從而調(diào)控與生長有關(guān)的基因表達(dá)[7]。超表達(dá)CCCH型鋅指蛋白基因AtZFP1可通過保持離子平衡，提高轉(zhuǎn)基因植物抗氧化性，從而賦予其耐鹽性。進(jìn)一步研究表明AtZFP1可以調(diào)節(jié)一些應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，如SOS1，AtP5CS1，KIN1，RD29B和RD22介導(dǎo)脅迫耐受性[8]。ZFP36是一種水稻C2H2型鋅指蛋白，被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)晚期SOD和APX基因的表達(dá)增強(qiáng)了它們的活性，因此在抗氧化防御和氧化作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。來自菊花的鋅指基因BBX24，在調(diào)節(jié)開花時(shí)間方面起雙重作用并且通過影響GA生物合成來影響植株對非生物脅迫的耐受性[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtZAT6蛋白可調(diào)節(jié)C2H2型鋅指蛋白表達(dá)，廣泛參與植物生長、發(fā)育和代謝，以及植物對低溫、高鹽和干旱等非生物逆境響應(yīng)，擬南芥ZFP5基因通過直接調(diào)控ZFP8的表達(dá)來調(diào)節(jié)表皮毛發(fā)育[10]。水稻OsZFP1作為負(fù)調(diào)控因子，能抑制鹽脅迫相關(guān)基因表達(dá)，降低轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫抗性。同時(shí)，OsZFP1的逆境響應(yīng)還受脫落酸(ABA)影響，暗示其可能參與ABA依賴的逆境響應(yīng)過程[11]。

楊樹是林木分子育種和基因工程研究的模式植物，并且是日常生活和生產(chǎn)中重要的用材樹種，然而各種逆境環(huán)境嚴(yán)重影響了楊樹的存活率和生長發(fā)育。因此通過對轉(zhuǎn)錄因子抗逆功能的挖掘，利用基因工程技術(shù)向楊樹體內(nèi)轉(zhuǎn)入抗逆基因是楊樹抗逆育種的有效途徑。本研究從毛果楊中鑒定獲得5條ZFP基因，對其序列特征和逆境脅迫后的表達(dá)模式進(jìn)行分析，初步鑒定毛果楊ZFP基因是否參與抗逆脅迫應(yīng)答反應(yīng)，為研究和揭示林木逆境響應(yīng)的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為楊樹抗逆基因工程育種提供基因材料。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理方法

選取長勢良好且一致的毛果楊組培苗，待生根苗長至5 cm左右時(shí)移栽到基質(zhì)為3∶1(v/v)的草炭土和蛭石混合基質(zhì)中，溫室平均溫度控制在25±1℃，光暗周期14 h/10 h，光強(qiáng)為400 μmol·m-2·s-1，適時(shí)澆水。待株高約為10 cm時(shí)進(jìn)行脅迫處理。分別采用0.2 mol·L-1NaCl、15%聚乙二醇(PEG6000)和100 μmol·L-1脫落酸(ABA)根部澆灌處理，每48 h澆灌一次，同時(shí)澆水處理作為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。于處理6、12、24、48、72和144 h后，分別取各處理和對照毛果楊的根、莖、葉組織，立即放入液氮中冷凍，保存于-80℃冰箱中用于RNA提取。

1.2 毛果楊ZFP基因的生物信息學(xué)分析

從楊樹基因組數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/)中獲得5條ZFP轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，利用ExPaSy在線Protparam軟件(http://web/expasy/org/protparam/)分析獲得ZFP蛋白的分子量和等電點(diǎn)等。利用在線軟件GSDS2.0對ZFP基因的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用在線軟件MEME對5個(gè)ZFP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，同時(shí)對5條毛果楊ZFP基因的染色體定位情況進(jìn)行研究。利用NCBI中的BLAST程序?qū)Λ@得的序列進(jìn)行比對，搜索同源性高的其他3個(gè)物種的ZFP蛋白氨基酸序列，使用BioEdit對楊樹ZFP轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行比對分析。包括與胡楊(Populuseuphratica)、白楊(Populusalba)、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)。從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/)中得到132條ZFP基因的氨基酸序列，利用MEGA5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建。利用ClustalX2.1和MEME對楊樹ZFP轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行基因保守元件(conserved motifs)的多元比較分析。

1.3 RNA提取和cDNA合成

利用PBIOZOL plant Total RNA試劑提取各處理材料的總RNA。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳評估提取RNA的完整性，并用Nanovue微型光度計(jì)檢測其濃度。逆轉(zhuǎn)錄按照Prime ScriptTMRT reagents Kit(TAKALA)說明，兩步法進(jìn)行cDNA合成。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?2℃ 30 min，85℃ 6 min。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍后，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

選擇毛果楊A(yù)ctin基因?yàn)閮?nèi)參基因，根據(jù)5條PtrZFP基因和actin基因序列設(shè)計(jì)定量引物(表1)。以各處理和對照毛果楊的根、莖、葉cDNA為模板，用各基因定量引物進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR的反應(yīng)體系為2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10.0 μL，10 μmol·L-1F和R引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，加水補(bǔ)至20.0 μL。采用2-ΔΔ(Ct)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，非脅迫處理(對照)表達(dá)水平設(shè)定為1。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

Table 1 The primers sequences using in qRT-PCR

基因Gene引物Primer序列Sequence(5′→3′)ActinActin-FActin-RAGGTTATGCCCTTCCACACGAGGGCAACATACGCAZFP1ZFP1-DL-FZFP1-DL-RGCCAGTATTGTTTCAAGGAGAGAGCGTGAACTGATCAGGZFP2ZFP2-DL-FZFP2-DL-RAGGATGAAAGTCCGACGAGGCCTTGGTTATACACTTCCZFP3ZFP3-DL-FZFP3-DL-RGCTGAAGCAATACCACGAGTGTGGCCTTACTGGTTGTGZFP4ZFP4-DL-FZFP4-DL-RTCACGTACTACAGCTGAAGCCTATCCCTAGGGATCGGAATZFP5ZFP5-DL-FZFP5-DL-RGTCGCAAATAGTGAGCTCCTCGACTCGAGTTACTACTTGC

表2 毛果楊5個(gè)PtrZFP基因序列特征

圖1 毛果楊ZFP家族外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及保守motif分析Fig.1 Exon-intron structure and conserved motif analysis of ZFP genes

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrZFP基因的獲得及序列分析

通過查找，共獲得5條毛果楊PtrZFP基因。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)這5個(gè)基因具有完整的開放讀碼框，因此推測為全長基因，命名為PtrZFP1-5。5個(gè)PtrZFP蛋白都至少具有一個(gè)典型的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。其中，PtrZFP2和PtrZFP5屬于CCCH類型，其他3個(gè)PtrZFP轉(zhuǎn)錄因子均屬于C2H2類型。這5個(gè)PtrZFP基因編碼蛋白推測的氨基酸殘基數(shù)為258～338 aa，預(yù)測的分子質(zhì)量數(shù)為27.7～37.3 kDa，理論等電點(diǎn)為4.87～8.61(表2)。預(yù)測PtrZFP1定位于細(xì)胞外周質(zhì)，PtrZFP2定位于細(xì)胞質(zhì)，而PtrZFP3-5定位于細(xì)胞外膜(表2)。DNA結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，PtrZFP2和PtrZFP5分別包含1或2個(gè)內(nèi)含子序列，其他轉(zhuǎn)錄因子沒有內(nèi)含子序列(圖1)。此外，PtrZFP2和PtrZFP5的motif基序數(shù)目多于其他轉(zhuǎn)錄因子(圖1)?；蛟谌旧w上的定位結(jié)果顯示，5條基因不均勻的分布在3條染色體上，其中4號(hào)染色體上1條，10號(hào)和17號(hào)染色體上各兩條(圖2)。

利用NCBI搜索毛果楊ZFP轉(zhuǎn)錄因子的同源序列，選擇與其同源性較高的3種植物進(jìn)行同源性分析和多序列比對。多序列比對結(jié)果顯示，PtrZFP2和PtrZFP5不包含C2H2型鋅指蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，不屬于C2H2型鋅指蛋白(圖3)。PtrZFP1、PtrZFP3、PtrZFP4與其他三個(gè)物種相似度較高，并且包含C2H2型鋅指蛋白的保守結(jié)構(gòu)序列“QALGGH”，屬于典型的C2H2類鋅指蛋白。

圖2 毛果楊ZFP基因在染色體上的定位Fig.2 Localization of ZFP genes of Populuson chromosome

圖3 ZFP氨基酸序列多序列比對Fig.3 The multiple sequence alignment of ZFP genes

圖4 ZFP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 The evolutionary tree analysis of PtrZFP with Arabidopsis thaliana ZFP proteins

為進(jìn)一步分析毛果楊ZFP蛋白的進(jìn)化關(guān)系，將查找獲得的132個(gè)擬南芥ZFP基因與5個(gè)毛果楊ZFP基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析(圖4)。聚類分析結(jié)果表明，擬南芥ZFP蛋白可分為13組，而5個(gè)PtrZFP蛋白分為2個(gè)亞組：Ⅰ和Ⅻ。其中，Ⅰ類是較大的亞組屬于C2H2類蛋白，3個(gè)PtrZFP蛋白，即ZFP1、ZFP3和ZFP4歸為該組；而ZFP2和ZFP5屬于Ⅻ類亞組，均屬于CCCH類蛋白。

2.2 毛果楊PtrZFP基因應(yīng)答逆境脅迫表達(dá)模式分析

為了初步了解毛果楊PtrZFP1-5基因的功能，利用qRT-PCR技術(shù)分析了這5個(gè)PtrZFP基因在鹽、干旱和ABA脅迫下毛果楊根、莖、葉中的表達(dá)特征。

2.2.1 NaCl脅迫下毛果楊ZFP家族基因表達(dá)模式分析

根中，5個(gè)PtrZFP基因都至少在2～3個(gè)研究時(shí)間點(diǎn)明顯被上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，其中PtrZFP1的表達(dá)量在鹽脅迫早期(6 h)就被明顯誘導(dǎo)(為對照的4.02倍)。PtrZFP2和PtrZFP5基因在24 h內(nèi)對鹽脅迫產(chǎn)生顯著響應(yīng)，均在24 h達(dá)到最高表達(dá)水平(分別為對照的8.08和4.88倍)。

莖中，鹽脅迫后，PtrZFP2，3和5在所研究的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量變化都不明顯(表達(dá)量變化在0.5～2.0)。而PtrZFP1和PtrZFP4在所有脅迫時(shí)間點(diǎn)都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，且在一半以上的時(shí)間點(diǎn)，被鹽脅迫明顯誘導(dǎo)。最高表達(dá)水平均出現(xiàn)在鹽脅迫144 h，分別為對照的7.55和5.24倍。而在脅迫初期(6 h)，表達(dá)量即達(dá)到一個(gè)較高水平，分別達(dá)到對照的4.15和3.98倍。

葉中，PtrZFP1的表達(dá)與根和莖類似，在所有時(shí)間點(diǎn)都上調(diào)表達(dá)，144 h表達(dá)量為對照的6.77倍。同樣PtrZFP3也與莖中相似，對鹽脅迫無明顯應(yīng)答。而PtrZFP2，4，5在葉中的表達(dá)模式與莖明顯不同。尤其是PtrZFP2，其在葉中表達(dá)在所有時(shí)間點(diǎn)都受抑制，且絕大部分時(shí)間點(diǎn)抑制效果明顯。PtrZFP4除脅迫48 h表達(dá)量差異明顯，其余時(shí)間點(diǎn)都無明顯應(yīng)答。而PtrZFP5在絕大部分時(shí)間點(diǎn)表達(dá)被抑制。

圖5 NaCl脅迫處理下毛果楊ZFP基因表達(dá)模式Fig.5 Expression analysis of ZFP genes in response to NaCl

圖6 PEG6000脅迫處理下毛果楊ZFP基因表達(dá)模式Fig.6 Expression analysis of ZFP genes in response to PEG6000

圖7 ABA脅迫處理下毛果楊ZFP基因表達(dá)模式Fig.7 Expression analysis of ZFP genes in response to ABA

2.2.2 聚乙二醇(PEG6000)脅迫下毛果楊ZFP家族基因表達(dá)模式分析

根中，PtrZFP1、PtrZFP3和PtrZFP4能夠明顯被滲透脅迫(PEG處理)誘導(dǎo)表達(dá)，且均在48h達(dá)到表達(dá)量的峰值，分別為對照的7.64、6.08和6.60倍。PtrZFP2和PtrZFP5在整個(gè)脅迫過程中表達(dá)量變化相對較小，在脅迫前期(6 h)為下調(diào)表達(dá)，分別為對照的47%和53%，隨后表達(dá)量上調(diào)，脅迫24 h時(shí)表達(dá)量最高，為對照的2.48和2.74倍，隨后基本恢復(fù)到正常水平。

莖中，PtrZFP1-5與根中的表達(dá)模式相同，PtrZFP1、PtrZFP3和PtrZFP4表達(dá)明顯被上調(diào)，且在脅迫72 h時(shí)差異最明顯，分別為對照的5.44、3.58和2.98倍。PtrZFP2和PtrZFP5在脅迫前期(6 h)為下調(diào)表達(dá)，分別為對照的46%和61%，隨后被上調(diào)表達(dá)，脅迫48 h時(shí)表達(dá)量最高，為對照的2.53和2.74倍。

葉中，表達(dá)模式與根和莖中明顯不同。PtrZFP1在所有脅迫時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)外，PtrZFP2主要表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，在脅迫早期(6 h)其表達(dá)就被迅速抑制，表達(dá)量僅為正常水平的19%，72 h及以前PtrZFP2基因均為明顯下調(diào)表達(dá)，而144 h表達(dá)恢復(fù)到正常水平。而PtrZFP3，4和5在所有研究的時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均無明顯改變(除PtrZFP5在脅迫72 h被下調(diào)表達(dá))。

2.2.3 脫落酸(ABA)處理下毛果楊ZFP家族基因表達(dá)模式分析

根中，PtrZFP1、PtrZFP3、PtrZFP5的表達(dá)整體上發(fā)生了明顯改變，主要為上調(diào)表達(dá)。分別在24、72和48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高水平，分別為對照的4.08、3.64和2.5倍。而PtrZFP2和PtrZFP4在ABA處理后，表達(dá)量無明顯變化。

莖中，PtrZFP1在ABA處理前期(48 h)均做出比較明顯的響應(yīng)，處理6 h時(shí)，表達(dá)量是對照的2.56倍。PtrZFP2在處理前期與非脅迫處理無明顯差異，但在處理12～144 h時(shí)間內(nèi)，PtrZFP2基因處于下調(diào)水平，48 h到達(dá)最低水平，僅為非處理的18%。而PtrZFP3，4和5的表達(dá)除個(gè)別時(shí)間點(diǎn)(1個(gè)時(shí)間點(diǎn))發(fā)生了明顯改變外，絕大部分時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與對照相比，差異不明顯。

葉中，PtrZFP1和3的表達(dá)沒有受到ABA處理的明顯影響。而PtrZFP2基因在所有被研究的時(shí)間點(diǎn)均為下調(diào)表達(dá)，處理48 h時(shí)PtrZFP2基因表達(dá)量水平最低，為對照組的21%。PtrZFP5基因在ABA處理時(shí)也主要被抑制表達(dá)，48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)最低(為對照組的17%)。PtrZFP4基因在ABA處理前期，表達(dá)量變化不明顯，而后期發(fā)生了明顯改變。

3 討論

本研究從毛果楊中克隆獲得了5條ZFP基因，其中PtrZFP2和PtrZFP5屬于CCCH類型，PtrZFP1、PtrZFP3和PtrZFP4屬于C2H2類型。植物C2H2類鋅指蛋白能對靶向DNA進(jìn)行識(shí)別[1]。Dathan等研究發(fā)現(xiàn)擬南芥SUPERMAN基因可對靶DNA進(jìn)行獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[12]。迄今在矮牽牛(Petuniahybridavilm)中總共發(fā)現(xiàn)了30多個(gè)C2H2型鋅指蛋白，鋅指區(qū)都含有“QALGGH”的保守序列，這些鋅指蛋白被稱為矮牽牛EPF鋅指家族[13]。其中7個(gè)鋅指蛋白主要在花藥中表達(dá)，5個(gè)為特異表達(dá)，可能參與花藥發(fā)育調(diào)節(jié)[14]。植物C2H2鋅指蛋白除了參與植物的生長發(fā)育外，也可能與植物逆境脅迫相關(guān)[1]。擬南芥STZ是第一個(gè)被證明同鹽脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它在調(diào)控與耐鹽性有關(guān)的下游基因的表達(dá)中可能起關(guān)鍵作用[15]。Sakamoto等發(fā)現(xiàn)AZF2可能是參與依賴于ABA的信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)因子，另外還發(fā)現(xiàn)AZF2在擬南芥受到鹽脅迫時(shí)的根部大量表達(dá)，推測其參與調(diào)控鹽脅迫下與根生長有關(guān)的基因表達(dá)[16]。

與C2H2型鋅指蛋白相似，CCCH型鋅指蛋白也能參與植物的生長發(fā)育并受到不同脅迫的誘導(dǎo)[17]。Sun等發(fā)現(xiàn)AtSZF1和AtSZF2在擬南芥中負(fù)調(diào)控鹽脅迫相關(guān)基因的表達(dá)[18]。Li等在1998年發(fā)現(xiàn)擬南芥的一個(gè)鋅指蛋白PEI1參與了心胚的形成過程[19]。CsSEF1基因編碼參與黃瓜體細(xì)胞胚胎發(fā)育過程[20]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的SOMNUS蛋白，對光依賴種子發(fā)芽的下游蛋白起負(fù)調(diào)控作用[21]。OsLIC則控制水稻葉片和分蘗角度影響水稻結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響稻谷產(chǎn)量[22]。

為了初步了解毛果楊ZFP基因的功能，利用qRT-PCR技術(shù)分析了這5條ZFP基因在毛果楊受鹽、干旱和ABA等脅迫處理后的表達(dá)情況。表達(dá)模式分析表明，PtrZFP1-5基因都能至少在一個(gè)器官中對鹽、旱以及ABA脅迫處理做出應(yīng)答。其中，在高鹽、干旱和ABA3種脅迫處理后，PtrZFP1基因在根、莖、葉中均為上調(diào)表達(dá)，表明該基因可能能參與這3種脅迫應(yīng)答。而PtrZFP2基因在高鹽、滲透和ABA脅迫后，在葉中的表達(dá)明顯被抑制，表明該基因可能在葉中發(fā)揮功能。而PtrZFP3基因在受到干旱脅迫時(shí)在根中的響應(yīng)最為明顯，高鹽和ABA處理?xiàng)l件下在根、莖、葉中的表達(dá)與對照相比差異較小，推測該基因特異性在干旱脅迫后根中起作用。PtrZFP5基因在經(jīng)受高鹽和ABA脅迫后，在葉中主要表現(xiàn)為下調(diào)。表明該基因發(fā)揮作用的器官可能是葉中，參與葉中ABA信號(hào)途徑的鹽脅迫應(yīng)答。在后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步對這些PtrZFP基因在毛果楊逆境脅迫應(yīng)答過程中的具體功能和機(jī)制進(jìn)行分析。