■黃百祺 胡林青 王如意 李詠梅 吳巨賢*

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣東廣州510430；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣東廣州510520）

近年來，由于在養(yǎng)殖過程中不合理使用抗生素導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性不斷升級(jí)，甚至出現(xiàn)多重耐藥性，開發(fā)新型飼用抗菌藥物迫在眉睫。我國具有大量寶貴的中藥資源，無論在感染控制還是在現(xiàn)代醫(yī)療方面都顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，成為抗生素替代物的重要來源之一。

大高良姜[Alpinia galanga (L.) Willd.]為姜科山姜屬植物紅豆蔻的根莖，民間常用作烹調(diào)加工香料。已探明大高良姜含有揮發(fā)油類、二苯庚烷類、黃酮類、苯丙素類、糖苷類等多種活性成分[1-2]，具有抗癌、抗氧化、抗?jié)兒鸵种泣S嘌呤氧化酶等作用[3-5]。研究報(bào)道大高良姜的同屬植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）具有較好的抑菌活性，如李鐘美等[6]研究表明高良姜提取物具有廣泛的抑菌譜，抑菌效果強(qiáng)于常用食品防腐劑山梨酸鉀、苯甲酸鈉；汪光華等[7]考察了高良姜中4種黃酮類化合物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對(duì)其較敏感，而黑曲霉、大腸桿菌、白色念珠菌等對(duì)其敏感性較低；Rao 等[8]研究了高良姜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）與最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。但是，目前未見有大高良姜提取物抑菌活性與提取工藝的相關(guān)研究。

本試驗(yàn)旨在研究大高良姜不同溶劑提取物對(duì)飼料微生物污染中常見的4種細(xì)菌和2種真菌體外抑菌活性的影響，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化乙醇回流提取工藝，測(cè)定提取物的MIC、MBC以及對(duì)pH值、熱和紫外光的穩(wěn)定性，為進(jìn)一步開發(fā)利用大高良姜資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大高良姜購于廣東省惠來縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)廣東省中藥研究所黃意成主管中藥師鑒定為山姜屬紅豆蔻的根莖大高良姜。

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC25922）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、白色念珠菌（ATCC10231）購自溫州市康泰生物科技有限公司。 枯 草 芽 孢 桿 菌（ATCC6633）、黑 曲 霉（ATCC16404）由廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

水解酪蛋白瓊脂、葡萄糖美蘭水解酪蛋白瓊脂購自杭州濱和微生物試劑有限公司；水解酪蛋白胨肉湯購自廣東環(huán)凱微生物有限公司；慶大霉素藥敏紙片（10 μg/片）、空白藥敏紙片購自溫州市康泰生物科技有限公司；伏立康唑藥敏紙片（1 μg/片）購自O(shè)XOID公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

BPMJ-150F 型恒溫培養(yǎng)箱、DZF-6050 型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；WGZ-2XJ 型濁度計(jì)（上海昕瑞儀器儀表有限公司）；FE20K 型pH計(jì)[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 提取溶劑和指示菌篩選

1.4.1.1 提取液及抑菌紙片制備

新鮮大高良姜除雜、洗凈后切片，于55 ℃烘干后粉碎，粉末過80 目篩，4 ℃保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取大高良姜粉末4.0 g，按料液比1∶10（m∶V），分別以純化水、無水乙醇、乙酸乙酯和石油醚為溶劑，60 ℃攪拌回流提取3 h，抽濾除渣得各大高良姜提取液。提取液分別以0.22 μm無菌濾膜除菌，充分浸泡無菌空白藥敏紙片3 h，于55 ℃無菌條件下烘干，得各溶劑提取液的抑菌紙片。以各空白溶劑按上法制取陰性對(duì)照紙片。

1.4.1.2 抑菌試驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法[9]）

分別挑取各試驗(yàn)菌種單菌落至盛有適量滅菌生理鹽水的試管中，以0.5 號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁転閰⒈日{(diào)整菌懸液至相同濁度。用滅菌棉簽沾取少量菌懸液，于平板（細(xì)菌使用水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，真菌使用葡萄糖美蘭水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基）上進(jìn)行涂布。待涂布稍干后貼片，以各空白溶劑紙片為陰性對(duì)照，慶大霉素（細(xì)菌）和伏立康唑（真菌）藥敏紙片為陽性對(duì)照。貼片完畢，細(xì)菌和真菌平板分別置于37 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h和36 h，用游標(biāo)卡尺以十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，每組試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

以1.4.1.2 節(jié)結(jié)果中細(xì)菌和真菌抑菌圈分別最大的金黃色葡萄球菌和黑曲霉為指示菌，以乙醇為提取溶劑，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)[L9(34)]，考察乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）和液料比（D）等因素對(duì)大高良姜提取物抑菌活性的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)三次，并按最佳工藝條件驗(yàn)證三次。試驗(yàn)因素和水平見表1。

1.4.3 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定[10]

按正交試驗(yàn)最佳工藝條件進(jìn)行提取，提取液于55 ℃真空干燥至恒重。準(zhǔn)確稱取干燥提取物1.0 g，置于10.0 ml 棕色容量瓶中，以純化水溶解并稀釋至刻度，用0.22 μm 無菌濾膜除菌，取適量至水解酪蛋白胨肉湯試管中，以二倍遞減稀釋法將肉湯中提取物的 濃 度 依 次 稀 釋 至10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.019 5 mg/ml。分別將金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌懸液（調(diào)至與0.5 號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤瑵岫龋┙尤牒鳚舛忍崛∥锏乃饫业鞍纂巳鉁?，每?0 μl，以滅菌純化水為空白對(duì)照。各試管分別置于37 ℃（金黃色葡萄球菌）和28 ℃（黑曲霉）、200 r/min培養(yǎng)24 h，以無菌生長的最小濃度為大高良姜提取物的MIC，每組試驗(yàn)重復(fù)三次。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

在MIC的基礎(chǔ)上將各試管繼續(xù)培養(yǎng)12 h，以無菌生長的最小濃度為大高良姜提取物的MBC，每組試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4.4 大高良姜提取物穩(wěn)定性研究

按1.4.2節(jié)優(yōu)化后的提取工藝制備大高良姜提取物，以金黃色葡萄球菌和黑曲霉為指示菌，考察pH值、溫度、紫外光照射時(shí)間對(duì)提取物抑菌活性的影響。

1.4.4.1 大高良姜提取物的pH值穩(wěn)定性

將提取物分別用1 mol/l 的HCl 或1 mol/l 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0[6]，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)定不同pH值對(duì)提取物抑菌活性的影響。

1.4.4.2 大高良姜提取物熱穩(wěn)定性

將提取物分別置于60、70、80、90、100 ℃水浴保溫30 min，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)定不同溫度對(duì)提取物抑菌活性的影響。

1.4.4.3 大高良姜提取物紫外光照穩(wěn)定性

將提取物置于超凈工作臺(tái)紫外燈下，分別照射10、20、30、40、50、60 min，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)定不同紫外光照射時(shí)間對(duì)提取物抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑篩選

不同溶劑大高良姜提取物對(duì)各試驗(yàn)菌體外抑菌活性的影響結(jié)果見表2。由表2 可知，陽性對(duì)照抑菌圈的范圍符合非苛養(yǎng)菌紙片擴(kuò)散法質(zhì)量控制允許范圍（17～27 mm）[9]，表明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有參考價(jià)值，而陰性對(duì)照均無抑菌圈產(chǎn)生。大高良姜的乙醇、石油醚、乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和黑曲霉均有抑菌活性，對(duì)這兩種菌抑制作用大小均為乙醇提取物＞石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物；乙醇、石油醚、乙酸乙酯提取物對(duì)銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均沒有抑制作用，這可能是由于不同微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝特征所造成的。水提取物僅對(duì)大腸桿菌有抑制作用且抑菌圈較小，推測(cè)大高良姜中主要的抑菌物質(zhì)可能是脂溶性的。汪光華等[7]和程紅黨[11]的研究結(jié)果顯示大高良姜的同屬植物高良姜的提取物對(duì)黑曲霉沒有抑菌活性，這與本試驗(yàn)結(jié)果不同，可能是由于大高良姜含有不同的抑菌物質(zhì)所造成的。大高良姜的乙醇和石油醚提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌活性接近，但石油醚極易揮發(fā)且具有一定毒性。綜上所述，確定后續(xù)試驗(yàn)以金黃色葡萄球菌和黑曲霉為指示菌，以乙醇作為提取溶劑進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

表2 提取溶劑對(duì)大高良姜提取物體外抑菌活性的影響

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）和液料比（D）為考察因素，設(shè)置四因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化大高良姜抑菌物質(zhì)的提取工藝，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。由表3 可知，以金黃色葡萄球菌為指示菌時(shí)，各因素對(duì)提取物抑菌活性的影響大小為A（乙醇濃度）＞C（提取時(shí)間）＞D（料液比）＞B（提取溫度），最佳提取工藝組合為：A3B2C2D2。

以黑曲霉為指示菌時(shí)，各因素對(duì)大高良姜提取物抑菌活性影響差異較小，這可能是因?yàn)槊咕木z體具有一定的蔓延性，導(dǎo)致抑菌圈邊界不夠清晰。其中料液比由1∶15 提高到1∶20，這兩個(gè)水平下變化不明顯，考慮到成本和環(huán)保等因素，最佳提取工藝調(diào)整為A3B2C2D2。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 最佳提取工藝驗(yàn)證

按正交試驗(yàn)最佳工藝組合進(jìn)行提取，測(cè)得提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（25.02±1.56）mm，較優(yōu)化前提高了38.6%；對(duì)黑曲霉的抑菌圈直徑為（22.74±1.72）mm，較優(yōu)化前提高了33.7%，表明優(yōu)化后的工藝條件能較好地提取出大高良姜中的抑菌成分。

表4 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）試驗(yàn)

2.3 MIC和MBC的測(cè)定(見表4)

由表4可知，大高良姜提取物的濃度越高，其抑菌活性越強(qiáng)。大高良姜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和黑曲霉的MIC均為0.313 mg/ml，MBC分別為1.25 mg/ml和0.625 mg/ml，抑菌效果強(qiáng)于食品常用的防腐劑山梨酸鉀、苯甲酸鈉（對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 分別為2.5 mg/ml和25.0 mg/ml[8]）。

2.4 大高良姜提取物穩(wěn)定性研究

表5 pH值對(duì)大高良姜提取物抑菌活性的影響

2.4.1 大高良姜提取物的pH值穩(wěn)定性(見表5)

由表5可知，大高良姜提取物在pH值6.0時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和黑曲霉均具有抑菌活性，當(dāng)pH≤4.0或pH≥8.0時(shí)抑菌作用消失。當(dāng)pH值逐漸升高時(shí)，提取物的顏色逐漸由黃色（pH 值8.0）變?yōu)楹稚╬H 值10.0），甚至出現(xiàn)紅棕色沉淀（pH 值12.0），與劉曉蓉等[12]觀察到的現(xiàn)象類似，推測(cè)可能是提取物中含有較多的黃酮類化合物，其在堿性條件下不穩(wěn)定，易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致顏色改變。

2.4.2 大高良姜提取物的熱穩(wěn)定性

溫度對(duì)大高良姜提取物抑菌活性的影響見圖1。由圖1 可知，隨著溫度升高，大高良姜提取物的抑菌活性總體呈下降趨勢(shì)。經(jīng)60 ℃處理30 min 后，提取物的抑菌活性較未處理（以提取物制備時(shí)的提取溫度55 °C計(jì)）前明顯下降，這可能與其中某些抑菌物質(zhì)對(duì)溫度敏感有關(guān)[6]；相比60 ℃處理后的抑菌活性，提取物經(jīng)70、80 ℃處理后抑菌活性有所提高，這可能是因?yàn)樵谠摐囟确秶鷥?nèi)某些成分的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化或相互發(fā)生反應(yīng)，生成了新的具有抑菌活性的物質(zhì)；90 ℃處理組的抑菌活性急劇降低，這可能是由于某些具有抑菌活性的揮發(fā)油類物質(zhì)在較高溫度下易揮發(fā)所造成的[13]。

圖1 溫度對(duì)大高良姜提取物抑菌活性的影響

2.4.3 大高良姜提取物的紫外光照穩(wěn)定性

紫外光照對(duì)大高良姜提取物抑菌活性的影響見圖2。由圖2可知，隨著紫外光照射時(shí)間的延長，大高良姜提取物抑菌活性整體呈下降趨勢(shì)，表明其中含有某些見光易分解的物質(zhì)（如酚類）。對(duì)于黑曲霉，提取物照射30～50 min后，抑菌活性逐漸上升，這可能是由于提取物中某些成分經(jīng)紫外光照射后生成了對(duì)霉菌有抑制作用的物質(zhì)。

圖2 紫外光照射時(shí)間對(duì)大高良姜提取物抑菌活性的影響

3 討論

中草藥具有綠色、安全、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，是一種前景良好的綠色飼料添加劑。

本文采用抑菌圈法測(cè)定大高良姜不同溶劑提取物對(duì)飼料微生物污染中常見的4種細(xì)菌和2種真菌的體外抑菌活性，確定了乙醇為最佳提取溶劑。以試驗(yàn)菌中抑菌活性較好的金黃色葡萄球菌和黑曲霉為指示菌，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝；在最佳提取條件下所得的大高良姜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌圈分別為25.02 mm 和22.74 mm，優(yōu)于陽性對(duì)照藥物的抑菌效果，顯示出良好的抑菌活性；最小抑菌濃度均為0.313 mg/ml，最小殺菌濃度分別為1.25 mg/ml 和0.625 mg/ml，具有作為一種綠色天然抑菌劑的潛力。目前，國內(nèi)關(guān)于高良姜活性成分抑菌作用的文獻(xiàn)較多，但對(duì)其同屬植物大高良姜提取物抑菌活性的研究尚未見報(bào)道，本文為開發(fā)利用大高良姜資源和研究大高良姜的抑菌成分提供理論依據(jù)。