■王 帥 趙 琳 韓雨哲 孫永欣 任同軍*

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧大連116023）

牙鲆魚為暖溫性底層魚類，多在中國、日本等北太平洋沿岸水域活動(dòng)，不僅是我國重要的漁業(yè)對(duì)象，也是優(yōu)秀的增養(yǎng)殖品種[1]。牙鲆魚體呈長橢圓形、扁平，尾柄短而高。有眼側(cè)櫛鱗、無眼側(cè)圓鱗，側(cè)線在前部有顳上分枝，在胸鰭上方有彎曲。腹鰭基底均短，且左右近對(duì)稱。有眼側(cè)褐色，有暗色斑點(diǎn)，無眼側(cè)為白色[2]。在產(chǎn)卵和索餌時(shí)期，牙鲆魚有季節(jié)性的向淺水或深水處移動(dòng)的習(xí)性，其回游性小，回歸性強(qiáng)，由于其移動(dòng)范圍有一定界限，所以在不同范圍會(huì)有不同的群體[3]。

益生菌具有多種功能，包括調(diào)節(jié)體內(nèi)微生態(tài)的平衡、促進(jìn)機(jī)體的生長和防御病害等，多是利用對(duì)生物體內(nèi)或者外界環(huán)境有益的微生物菌株制作而成[4]。不同種類的益生菌對(duì)機(jī)體的作用機(jī)制不同，復(fù)合益生菌通常由2 種或2 種以上的益生菌復(fù)合制成，達(dá)到彼此作用互補(bǔ)或增強(qiáng)的效果[5-6]。因此市場上存在的微生態(tài)制劑多是復(fù)合益生菌制劑[7]。腸球菌是一種重要的乳酸菌，它參與宿主的多種生理功能,具有很重要的微生態(tài)學(xué)意義。益生腸球菌自身及其代謝產(chǎn)物可以協(xié)調(diào)菌群之間的關(guān)系，維持優(yōu)勢菌群的穩(wěn)定和平衡，還可作為非特異性免疫調(diào)節(jié)因子，增強(qiáng)非特異性免疫能力，從而提高機(jī)體抵抗病原菌的能力[8]。有研究表明，由腸球菌組成的益生菌可以降低飼養(yǎng)對(duì)象的死亡率，提高增重率等，且由腸球菌代謝產(chǎn)生的物質(zhì)具有提高機(jī)體免疫力、抑制病原菌等顯著功效[9]。本文通過研究飼料中添加不同劑量復(fù)合益生菌（主要成分為腸球菌）對(duì)牙鲆的生長性能和非特異性免疫能力的影響，探究復(fù)合益生菌制劑的促進(jìn)效果及其在飼料中的適宜添加量，為其在生產(chǎn)中應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)所用復(fù)合益生菌由大連百安泰生物科技有限公司提供，經(jīng)熱滅活后的菌粉，在上海派諾森生物科技股份有限公司進(jìn)行16S rDNA 鑒定，該復(fù)合益生菌主要含有Enterococcus、Clostridium-sensu-stricto-18、Paraclostridium，其相對(duì)豐度分別為0.253、0.202、0.19。

試驗(yàn)飼料以魚粉、豆粕、小麥粉、魚油、大豆油、大豆卵磷脂、預(yù)混料、磷酸二氫鈣、氯化膽堿和微晶纖維素為主要原料，將其混合均勻制成基礎(chǔ)飼料(T0 組)，處理組飼料在基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)合益生菌粉，T1、T2、T3 組的復(fù)合益生菌的添加量分別是飼料重量的0.5%、1.0%、1.5%。具體飼料配方見表1。將混合均勻的飼料成分放入制粒機(jī)(東南干燥設(shè)備有限公司，XL-250)壓成粒徑為3 mm 的顆粒，放入-20 ℃冰箱保存。

表1 牙鲆飼料配方及營養(yǎng)水平(%)

1.2 試驗(yàn)對(duì)象及飼養(yǎng)

牙鲆購于遼寧省大連市甘井子區(qū)營城子鎮(zhèn)雙臺(tái)溝村天正大黑石養(yǎng)殖場，先投喂基礎(chǔ)飼料一周適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境后，隨機(jī)挑選180 尾狀態(tài)良好、初始體質(zhì)量為(17.50±0.73) g 的牙鲆幼魚進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)開始前將180尾試驗(yàn)魚隨機(jī)分配到4×3個(gè)200 L圓形水槽中，每個(gè)水槽15 尾，分為四組，每組3 個(gè)重復(fù)，禁食24 h。飼養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行30 d，每日投喂兩次，分別在9:00 及18:00，按試驗(yàn)魚體重的2%投喂。每日投喂前，利用虹吸法吸取殘餌糞便。試驗(yàn)使用循環(huán)水方法養(yǎng)殖，養(yǎng)殖全程充氣，溫度與光照相同。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后迅速取樣，試驗(yàn)魚測定體質(zhì)量，用1 ml注射器在魚尾靜脈取血（注射器已提前用肝素鈉溶液潤洗），4 ℃靜置24 h后離心取上清液，測定血清部分非特異性免疫指標(biāo)。取血后于冰袋上解剖，將所取肝胰臟先于液氮中速凍，后保存于-80 ℃冰箱中用于分析非特異性免疫活性。

1.4 血清非特異性免疫指標(biāo)測定

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定ACP、AKP、CAT和T-SOD的活性。

1.5 肝胰臟非特異性免疫指標(biāo)測定

準(zhǔn)確稱取組織樣品，在4 ℃冰箱緩溶，肝胰臟按質(zhì)量體積比1∶9(W/V)的比例加入0.9%的生理鹽水，在冰浴條件下勻漿制成組織勻漿，采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定ACP、AKP、CAT、T-SOD 和LZM的活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Tukey's多重比較對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示，檢驗(yàn)組間差異以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合益生菌對(duì)牙鲆生長性能的影響（見表2）

表2 復(fù)合益生菌對(duì)牙鲆生長性能的影響

如表2所示，添加一定量的復(fù)合益生菌有提高牙鲆增重率的趨勢，當(dāng)添加量為0.5%和1.0%時(shí)，增重率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），當(dāng)添加量為1.5%時(shí)，與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 復(fù)合益生菌對(duì)牙鲆血清非特異性免疫指標(biāo)的影響（見圖1）

圖1 牙鲆血清非特異性免疫酶活性

為期30 d 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，如圖1 所示，與對(duì)照組T0 組相比，添加復(fù)合益生菌的T1、T2 組和T3 組的血清中ACP 活性顯著升高（P＜0.05）；T2 和T3 組的血清AKP 活性顯著升高（P＜0.05），T2 組T-SOD 活性顯著高于其他組（P＜0.05）；與T0 組相比，各處理組CAT活性無顯著性差異。

2.3 復(fù)合益生菌對(duì)牙鲆肝臟非特異性免疫指標(biāo)的影響（見圖2）

圖2 牙鲆肝臟非特異性免疫酶活性

為期30 d 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，如圖2 所示，與對(duì)照組T0組相比，添加復(fù)合益生菌的T2組和T3組的肝臟中ACP 活性顯著下降（P＜0.05）；T1、T2 組和T3 組的AKP 活性顯著下降（P＜0.05）；T1 組的T-SOD 活性比T0 組明顯升高（P＜0.05）；T2 組和T3 組的CAT 活性顯著高于T0 組（P＜0.05）；T1 組的LZM 活性明顯高于T0組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌對(duì)牙鲆生長的影響

有研究表明，飼料中添加適量的復(fù)合益生菌，可以顯著提高飼養(yǎng)對(duì)象的生長速度。賴凱昭等[11]研究顯示，添加復(fù)合益生菌試驗(yàn)組奧尼羅非魚的平均體重最大增幅達(dá)到了11.98%，表明復(fù)合益生菌可以促進(jìn)奧尼羅非魚的生長性能。劉愛君等[12]用含有微生態(tài)制劑的餌料飼喂羅非魚30 d 后，增重率提高了25.26%，表明復(fù)合益生菌可以促進(jìn)羅非魚的生長性能。劉淑蘭等[13]對(duì)大西洋鮭使用復(fù)合益生菌制劑，大西洋鮭的生長狀況明顯改變，增重率顯著升高。Wang 等[14]在糞腸球菌濃度為107CFU/ml 的水中養(yǎng)殖羅非魚40 d，試驗(yàn)組的體質(zhì)量及日增重比對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。黃旺等[15]在飼料中添加適量糞腸球菌(1.5×107CFU/g)投喂吉富羅非魚，不僅飼料的利用效率顯著提高，吉富羅非魚的增重率也顯著提高。劉翠玲[16]將糞腸球菌用殼聚糖包被，投喂鯉魚幼魚，發(fā)現(xiàn)添加量為600 mg/kg的糞腸球菌組的飼料可以顯著提高鯉魚幼魚的增重率和特定增長率（P＜0.05）。Dawood等[17]研究了經(jīng)滅活的植物乳桿菌對(duì)真鯛的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滅活的植物乳桿菌也可降低飼料系數(shù)，并且增強(qiáng)真鯛的生長性能。本研究中，牙鲆投喂了添加有復(fù)合益生菌的飼料后，生長性能顯著升高，與上述研究的結(jié)果相似。

3.2 復(fù)合益生菌對(duì)牙鲆血清非特異免疫指標(biāo)的影響

T-SOD 的活性可以反映機(jī)體的抗氧化能力和非特異性免疫防御能力，不但可以催化過氧化物自由基發(fā)生歧化，還可以清除掉自由基，同時(shí)可以防御機(jī)體衰老和活性氧對(duì)機(jī)體的傷害，是生物體內(nèi)存在主要的抗氧化酶類之一[18-19]。動(dòng)物體內(nèi)自由基的生成與機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)之間通常會(huì)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，抑制體內(nèi)氧自由基的生成在一定程度上可以反映動(dòng)物的抗氧化能力、應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫的能力和自身的生長性能等[20]。CAT 可以抵御機(jī)體衰老和活性氧對(duì)機(jī)體的傷害，可以清除體內(nèi)的活性氧，也是生物體內(nèi)存在主要的抗氧化酶類之一。ACP 可以水解外來異物表面上的磷酸酯，提升體內(nèi)吞噬細(xì)胞效率和降解異物的速度，還可以促進(jìn)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移和代謝，在養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫應(yīng)答、抵抗疾病等功能中體現(xiàn)重要作用[21-22]。血清中存在的ACP是高等動(dòng)物巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，其活性反映了動(dòng)物機(jī)體的免疫功能、應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫的能力和自身的生長性能等[23]。AKP 廣泛存在于各種動(dòng)物體內(nèi)，是動(dòng)物體內(nèi)重要的解毒體系，可以催化水解磷酸單酯，參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移過程[24]；AKP也是一種腸上皮刷狀緣膜酶，與魚類的消化間接相關(guān)[25-26]，一般認(rèn)為，魚體內(nèi)AKP 參與了魚腸上皮細(xì)胞的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，協(xié)助腸上皮細(xì)胞吸收葡萄糖、脂類、鈣和無機(jī)磷[27]。黃旺等[15]用添加適量糞腸球菌(1.4×105～1.5×107CFU/g)的飼料投喂吉富羅非魚，顯著增加了其血清堿性磷酸酶的活性。黃燕華等[28]選用5 種乳酸菌投喂奧尼羅非魚，糞腸球菌組血清中堿性磷酸酶活性有提高。鞠安琪等[29]選用3種不同濃度(1×107、1×108、1×109CFU/g)屎腸球菌的顆粒作為試驗(yàn)飼料飼喂健康鯉魚，試驗(yàn)組血清中堿性磷酸酶活性顯著提升。本研究中復(fù)合益生菌能夠顯著增加血清中酸性磷酸酶活性（P＜0.05），與對(duì)照組相比，投喂1.0%和1.5%復(fù)合益生素組的AKP 活性顯著升高（P＜0.05），投喂1.0%復(fù)合益生菌組的T-SOD活性顯著升高（P＜0.05）。

3.3 復(fù)合益生菌對(duì)牙鲆肝臟非特異性免疫的影響

LZM是一種消化酶，也是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的非特異性生物防御因子，可以殺滅和消化致病菌，因此參與到動(dòng)物的免疫防御中[30]。本研究中，投喂1.0%和1.5%的復(fù)合益生菌后牙鲆肝臟中ACP 和AKP 活性顯著降低（P＜0.05），添加復(fù)合益生菌的處理組0.5%、1.0%和1.5%組的血清中ACP活性顯著升高（P＜0.05），或是因?yàn)楫?dāng)肝臟受到損傷或者障礙時(shí)，以酶原形式存在于肝臟的AKP經(jīng)淋巴和肝竇進(jìn)入到血液中，同時(shí)肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙導(dǎo)致反流進(jìn)入血液，從而導(dǎo)致血清中AKP升高[10，31-32]。投喂1.0%的復(fù)合益生菌后牙鲆肝臟中T-SOD活性顯著降低，這與劉淑蘭等[13]研究中飼喂大西洋鮭復(fù)合益生菌制劑后T-SOD 活性降低的結(jié)果一致。其機(jī)理或可能是投喂的益生菌提高了機(jī)體腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量，進(jìn)而抑制了腸道其它有害菌的生長與繁殖[33-34]，腸道中有害菌的數(shù)量降低，使得有害菌侵染機(jī)體的功能下降，魚體呼吸爆發(fā)的頻率下降，超氧陰離子的水平也降低，T-SOD 的活性也隨之降低[13]。投喂0.5%復(fù)合益生菌后牙鲆LZM活性升高，表明肝臟中巨噬細(xì)胞的分泌和吞噬活性增強(qiáng)。投喂1.0%和1.5%的復(fù)合益生菌后牙鲆CAT 活性顯著升高，表明肝臟中抗氧化能力增強(qiáng)。

4 結(jié)論

綜上所述，飼料中添加復(fù)合益生菌制劑可以提高牙鲆某些非特異性免疫酶的活性，進(jìn)而可以顯著促進(jìn)牙鲆的生長，但1.0%和1.5%的添加水平不利于提高牙鲆某些非特異性免疫酶的活性。因此，在本試驗(yàn)條件下，復(fù)合益生菌制劑的適宜添加水平為0.5%。