■鄧 波 胡文鋒，* 李雪玲 李楚君 朱劍鋒

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510000；2.廣州無兩生物科技有限公司，廣東廣州510000；3.生物源生物技術（深圳）股份有限公司，廣東深圳518000）

昆蟲在過去幾十年中受到廣泛關注，被認為是潛在的可持續(xù)飼料原料來源[1]，是解決飼料蛋白質(zhì)來源缺乏等相關的全球問題的潛在解決方案[2]。特別是黑水虻幼蟲，在糧食和牲畜的大規(guī)模生產(chǎn)中有著巨大的潛力。與其他蒼蠅如家蠅相比，黑水虻幼蟲不是害蟲，因為它們在成年階段不進食。黑水虻幼蟲是適應能力強大的生物，可以在各種環(huán)境中茁壯成長[3]。使用糞便養(yǎng)殖的黑水虻幼蟲和蛹中含有豐富的必需氨基酸和礦物質(zhì)，是家禽和牲畜飼料中適合的飼料原料，其營養(yǎng)價值可與魚粉相媲美?，F(xiàn)有文獻表明，黑水虻幼蟲作為飼料原料的商用替代品具有很大潛力[4]。許多研究強調(diào)有可能用黑水虻幼蟲取代日益昂貴的飼料蛋白質(zhì)來源。黑水虻幼蟲蛋白質(zhì)含量（37%～63%）和脂肪含量（高達49%）高，它所含有的一些宏觀和微量營養(yǎng)素對人類健康和動物發(fā)育很重要[5]。研究還表明，黑水虻具有特定的抗菌特性，有可能作為飼料添加劑在飼料工業(yè)中應用[6]。黑水虻幼蟲對黃曲霉毒素B1、霉菌毒素和殺蟲劑等毒素也具有一定的降解能力。與肉類相比，昆蟲被認為是最佳的蛋白質(zhì)來源，因為它對環(huán)境的影響較小。黑水虻幼蟲生命循環(huán)周期評估表明：與其他動物相比，黑水虻幼蟲對環(huán)境的影響較小[7]。人們對黑水虻作為陸生動物和水生動物飼料的興趣逐年增長，越來越多的科學研究集中在這一主題上[8]。同時，黑水虻幼蟲被認為是用于動物飼料的重要候選物種，自20 世紀70 年代以來，該物種一直被用作動物飼料中的蛋白質(zhì)來源，這主要是因為它能夠以食物廢棄物為食后，其幼蟲和蛹含有高質(zhì)量的蛋白質(zhì)[9]。在一些魚類飼料中成功地用黑水虻幼蟲替代魚粉，并且其對魚類的生長性能沒有負面影響。

毛銀等[10]通過試驗，用一種高酸產(chǎn)量的乳酸菌DY6 作為發(fā)酵菌株，與未發(fā)酵豆粕相比，發(fā)酵豆粕中的粗蛋白含量增加6.23%，多肽含量增加223%，總酸含量增加1.8%，蛋白質(zhì)體外消化率增加17.85%。根據(jù)楊玉娟等[11]的調(diào)查分析：大豆球蛋白發(fā)酵后平均下降57.7%，胰蛋白酶抑制劑含量下降59.1%，β-伴大豆球蛋白含量下降63.2%，水蘇糖含量下降82.5%。魏春等[12]用乳酸菌發(fā)酵棉粕48 h 后，游離棉酚的降解率達到73.44%。史玉寧等[13]使用曲霉菌和酵母菌對豆粕進行復合固體有氧發(fā)酵，發(fā)酵7 d 后，發(fā)酵組中粗蛋白、粗脂肪含量分別增加5.6%和6.2%，而必需氨基酸和總氨基酸含量相對未發(fā)酵對照組分別增加了3.55%和8.14%。陸豫等[14]利用黑曲霉菌、植物乳酸桿菌和釀酒酵母菌一起發(fā)酵菜籽粕，發(fā)現(xiàn)單寧的降解率達到94.38%。馬文強等[15]利用乳酸桿菌發(fā)酵豆粕，發(fā)酵后硫代葡萄糖苷降解了30.73%，粗蛋白含量從38.41%提高到45.44%，多肽含量從0.8%提高到2.62%。使用發(fā)酵處理餅粕原料是當前研究的熱門，但是由于目前人們對微生物知識和發(fā)酵工藝了解不是很深刻，缺乏對原料的篩選評測，這些因素都影響著生物發(fā)酵飼料的質(zhì)量穩(wěn)定和安全。

本文對三種主要的餅粕和十余種抗營養(yǎng)因子進行了測試和分析，研究黑水虻幼蟲處理餅粕原料作為飼料生產(chǎn)新工藝的可行性，同時，為了減少對發(fā)酵工藝優(yōu)化的依賴性，研究中并未對發(fā)酵條件(溫度、發(fā)酵時間、水分等)進行優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 試驗設計和操作

①對空白餅粕組中抗營養(yǎng)因子和小肽的含量進行了測量。②將菌粉（0.25 g）加入餅粕中進行發(fā)酵(50 g餅粕和50 ml水混合，在27 ℃條件下發(fā)酵10 d)，測定發(fā)酵餅粕中的小肽和抗營養(yǎng)因子的含量。③將黑水虻幼蟲(50、100只和200只)分別添加到空白餅粕中(50 g空白餅粕和50 ml水混合，在27 ℃條件下喂養(yǎng)10 d)，然后測量和記錄數(shù)據(jù)（小肽和抗營養(yǎng)因子的含量）。④將黑水虻幼蟲(50、100 只和200 只)分別添加到發(fā)酵餅粕中(50 g發(fā)酵餅粕和50 ml水混合，在27 ℃條件下喂養(yǎng)10 d)。⑤利用Spss Statistics 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。具體的試驗設計見表1。

表1 試驗設計

1.2 黑水虻幼蟲

黑水虻幼蟲由華南農(nóng)業(yè)大學提供，3 g 黑水虻幼蟲卵放入試管中，并在室溫下孵育3 d，獲得黑水虻幼蟲。幼蟲孵育期間不需要喂食，因為它們在不進食的情況下可存活5 d。

1.3 餅粕

豆粕由生物源生物技術(深圳)股份有限公司提供，由中國南京市麗水區(qū)生產(chǎn)。棉籽粕購自石家莊市嘉惠街道的嘉惠飼料公司。菜籽粕購自江蘇省南京市欣悅農(nóng)家油坊。餅粕在使用前要搗碎，并用攪拌機攪碎，裝入包裝袋放入陰涼干燥處保存。

1.4 菌粉和培養(yǎng)

菌粉（由酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌組成，按照1∶0.5∶1.5比例混合而成）提供，由生物源生物技術(深圳)股份有限公司提供。實驗場所為華南農(nóng)業(yè)大學食品學院應用微生物實驗室。

1.5 化學分析

1.5.1 植酸

根據(jù)國家標準測定豆粕、菜籽粕、棉籽粕中的植酶含量（GB/T 18634—2009）。

1.5.2 單寧棉籽粕和菜籽粕中單寧的含量根據(jù)國家標準測量（GB/T 27985—2011）。

1.5.3 游離棉酚

根據(jù)國家標準方法（GB/T 27985—2011）,測定棉籽粕中游離酚的含量。

1.5.4 粗蛋白和小肽

根據(jù)國家標準方法測定豆粕、菜籽粕和棉籽粕中粗蛋白的含量（GB/T 6432—2018）。根據(jù)考馬斯亮藍試劑盒測定豆粕、棉籽粕和菜籽粕中小肽的總含量。試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.5.5 胰蛋白酶抑制劑和β-伴大豆球蛋白

根據(jù)國家標準方法測量豆粕中胰蛋白酶抑制劑的活性（GB 5009.224—2016）。根據(jù)ELISA 試驗試劑盒測定豆粕中β-伴大豆球蛋白的含量。試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.5.6 總戊聚糖和可溶性戊聚糖

根據(jù)我國農(nóng)業(yè)標準（NY/T 2335—2013）測量豆粕中戊聚糖和可溶性戊聚糖的含量。

1.6 統(tǒng)計分析

通過Spss Statist ics 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。同時，通過多重比較重點顯示了添加黑水虻幼蟲的空白組和添加了黑水虻幼蟲的發(fā)酵組之間的差異。P＜0.05 被認為是顯著性差異。所有的數(shù)據(jù)都是經(jīng)過三次試驗所取的平均值。

2 結果

2.1 豆粕的重量、小肽以及抗營養(yǎng)因子的變化

2.1.1 豆粕中小肽和抗營養(yǎng)因子含量的變化(見表2)

表2 不同處理方法對豆粕中小肽和抗營養(yǎng)因子含量的影響

如表2所示，對比空白豆粕組，S2和S3(S3-50、S3-100 和S3-200)中脲酶的降解率分別為63%和22%、33%、60%；同時，S4(S4-50、S4-100 和S4-200)中脲酶的降解率分別達到48%、52%和85%?？傮w而言，豆粕中脲酶的活性隨著黑水虻幼蟲數(shù)量的增加而降低。

與空白組相比，在S2、S3-50和S3-100中β-伴大豆球蛋白的降解率分別為18%、40%和9%(表2)。S4中β-伴大豆球蛋白的降解率分別為70%、69%和59%。顯然，隨著黑水虻數(shù)量的增加，豆粕中β-伴大豆球蛋白的含量不斷上升。

S2 中粗蛋白含量相對于空白豆粕組下降了19%。而S3 粗蛋白的含量只有25.9%、27.12%和31.25%。S4 中粗蛋白含量分別為32.76%、39.35%和42.87%。這表明，用黑水虻處理豆粕，不能增加空白豆粕組中粗蛋白的含量，但可以增加發(fā)酵豆粕中粗蛋白的含量。

通過單因素多重比較S2、S3-200和S4-200可知，它們之間所含的小肽、粗蛋白、β-伴大豆球蛋白、可溶性戊聚糖和植酸含量差異性顯著(P＜0.05)。值得注意的是，S2和S3-200的胰蛋白酶抑制因子差異性并不顯著(P＞0.05)，這說明黑水虻幼蟲對于處理空白豆粕組的胰蛋白酶抑制因子的效果并不明顯，但是隨著黑水虻幼蟲數(shù)量的增加，胰蛋白酶抑制因子的含量是不斷降低的。

2.1.2 黑水虻幼蟲處理豆粕后樣品的重量變化(見圖1)

圖1 黑水虻處理豆粕前后其重量的變化

如圖1 所示，使用黑水虻幼蟲處理豆粕后，樣品的重量沒有顯著變化(平均減少了0.81 g/50 g)。因此，利用黑水虻處理豆粕是一種可行的方法，因為這不會影響飼料生產(chǎn)的成本，造成豆粕原料的損失。

2.2 棉籽粕的重量、小肽以及抗營養(yǎng)因子的變化

2.2.1 棉籽粕中小肽和抗營養(yǎng)因子含量的變化(見表3)

表3 不同處理方法對棉籽粕中小肽和抗營養(yǎng)因子含量的影響

如表3 所示，相對于空白棉籽粕組，P2 和P3(P3-50、P3-100 和P3-200）中單寧的降解率分別達到了39%和33%、42%、43%；同時，P4（P4-50、P4-100 和P4-200）中單寧的降解率分別達到21%、26%和30%。

與P1 相比，P2 中粗蛋白含量下降了26%，而P3-100 和P3-200 中粗蛋白的含量分別增加6%和8%。與P1相比，P4中粗蛋白的含量分別增加了3%、6%和11%。結果表明，用黑水虻處理菜籽粕可以顯著增加其粗蛋白的含量，并且隨著黑水虻幼蟲數(shù)量的增加，樣品中粗蛋白的含量也不斷上升。根據(jù)T1、T2和T3多重比較可知，總體來看，這三組中所含的小肽和抗營養(yǎng)因子含量差異顯著(P＜0.05)，只有T1中的單寧的差異性為0.15(P＞0.05)，這說明黑水虻幼蟲對于空白棉籽粕中的單寧降解能力并不有效，但這與黑水虻幼蟲的數(shù)量密切相關，如表3所示，隨著黑水虻幼蟲數(shù)量的增加，棉籽粕中單寧的含量不斷下降。

2.2.2 黑水虻幼蟲處理棉籽粕后樣品的重量變化（見圖2）

圖2 黑水虻處理棉籽粕前后其重量的變化

如圖2 所示，整體上看，用黑水虻幼蟲處理棉籽粕后其重量都有不同程度的減少，平均減少了1.5 g/50 g。由此可得：利用黑水虻幼蟲處理棉籽粕不會對棉籽粕飼料的生產(chǎn)造成影響。

2.3 菜籽粕的重量、小肽和抗營養(yǎng)因子含量的變化

2.3.1 菜籽粕中小肽和抗營養(yǎng)因子含量的變化(見表4)

如表4 所示，相對于空白菜籽粕組，D2 中單寧的降解率為40%，而D3（D3-50、D3-100和D3-200）中單寧的降解率分別為41%、43%和48%。與D1相比，D4（D4-50、D4-100 和D4-200）中單寧的降解率分別為43%、45%和50%。這表明單寧的降解率隨著黑水虻幼蟲數(shù)量的增加而升高。

與D1 相比，發(fā)酵菜籽粕中粗蛋白的含量增加13%，D3（D3-50、D3-100 和D3-200）和D4（D4-50、D4-100 和D4-200）中粗蛋白含量分別為29.4%、31.6%、33.6%和23.3%、31.47%、34.7%。

通過對G1、G2 和G3 進行多重比較可得，從總體來看，利用黑水虻幼蟲處理菜籽粕后各組中所含的小肽和抗營養(yǎng)因子含量都有顯著性變化(P＜0.05)，只是G3 中單寧、噁唑烷硫酮和植酸的含量卻沒有明顯的差異(P＞0.05)，這說明在利用黑水虻幼蟲處理菜籽粕時，無論菜籽粕是否經(jīng)過發(fā)酵，都不會影響對其單寧、植酸和噁唑烷硫酮的降解效果。

2.3.2 黑水虻幼蟲處理菜籽粕后樣品的重量變化（見圖3）

表4 不同處理方法對菜籽粕中小肽和抗營養(yǎng)因子含量的影響

如圖3 所示，菜籽粕經(jīng)過黑水虻幼蟲處理后其重量都有不同程度的減少，平均下降了3.8 g/50 g。這說明了黑水虻處理菜籽粕對其重量的影響具有不穩(wěn)定性，特別是菜籽粕經(jīng)過黑水虻幼蟲處理后，其重量的減少量遠遠高于豆粕(0.81 g/50 g)和棉籽粕(1.5 g/50 g)，因此，黑水虻幼蟲處理菜籽粕并不適合大規(guī)模的飼料生產(chǎn)，因為這會造成菜籽粕原料的損失。

圖3 黑水虻處理菜籽粕前后其重量的變化

3 討論

使用黑水虻幼蟲處理發(fā)酵餅粕可大大提高其小肽的含量。李永凱等[16]將豆粕用枯草芽孢桿菌發(fā)酵處理后其小肽的含量增加4.35%。本研究中，與S1(表2)相比，S4 中小肽的含量分別增長366%、462%和657%。這些比文獻中所描述的含量高得多。艾慶輝等[17]發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵棉籽粕和發(fā)酵酶水解產(chǎn)品中，小肽的含量分別提高到19.41%和23.59%。夏尚培[18]利用酵母菌Y-619 發(fā)酵使棉籽粕中小肽的含量增加了10.93%。本研究中(表3)，P4-200 中小肽的含量相比空白棉籽粕組增加了630%。陳娟等[19]發(fā)酵菜籽粕后，其小肽的含量增加了18.36%。在我們的研究中，與D1(表4)相比，D4中小肽的含量分別增加了320%、408%和468%，這與豆粕和棉籽粕的研究基本相符。結果表明，用黑水虻幼蟲處理的發(fā)酵豆粕、棉籽粕和菜籽粕其小肽的含量明顯高于發(fā)酵餅粕。原因可能是黑水虻幼蟲中存在豐富的小肽，或者黑水虻幼蟲可以將餅粕中的氨基酸轉化為小肽。

用黑水虻幼蟲處理豆粕后其胰蛋白酶抑制劑的含量明顯下降。余冰等[20]測得豆粕和發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制劑的平均含量分別為18.4 mg/g 和7.5 mg/g，發(fā)酵后胰蛋白酶抑制劑的含量下降了59.1%。王芳等[21]對豆粕進行發(fā)酵后其胰蛋白酶抑制劑的含量減少77.8%。劉萍等[22]發(fā)酵豆粕后其胰蛋白酶抑制劑的降解率達到了57.24%。本研究與S1 相比，S3-200 中豆粕的胰蛋白酶抑制因子的降解率達到44%(表2),這低于文獻中描述的水平，但豆粕胰蛋白酶抑制因子的降解率在S4-200 中達到了63%(表2)，這是添加了黑水虻幼蟲的結果。此外，隨著黑水虻幼蟲數(shù)量的增加，豆粕中胰蛋白酶抑制因子的降解率呈上升趨勢。原因可能是黑水虻幼蟲可以分散形成胰蛋白酶抑制因子的蛋白質(zhì)，防止其各種蛋白質(zhì)形成混合物，從而減少胰蛋白酶抑制因子的含量。

本試驗研究表明，用黑水虻幼蟲處理餅粕對其植酸有明顯的降解作用。李莉娜等[23]用混合的枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌和植物乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕后，其植酸的降解率達到了18.5%。在本試驗中，S3-200、P3-200 和D3-200（表2、表3 和表4）中植酸的降解率最高分別為37%、79%和97%。而在S4-200、P4-200和D4-200中植酸的降解率最高分別達到了63%、87%和98%（表2、表3和表4）。這些降解率明顯高于其他文獻中描述的，而且，隨著黑水虻幼蟲數(shù)量的增加，餅粕的降解率持續(xù)增加。其原因可能是用黑水虻幼蟲處理餅粕時，可以幫助餅粕從植酸鹽中提取磷、鈣、鎂等礦物質(zhì)元素，減少植酸的形成，從而降低植酸含量。

隨著棉籽粕中黑水虻幼蟲的增加，其游離棉酚的降解率也不斷升高。亓秀曄等[24]用枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉籽粕，發(fā)現(xiàn)游離棉酚的降解率達到了93.89%。卜小麗等[25]采用生物和物理方法處理棉籽粕，結果發(fā)現(xiàn)棉籽粕中游離棉酚的降解率可達90.57%。肖永友等[26]利用酵母菌Y-619 發(fā)酵棉籽粕后發(fā)現(xiàn)游離棉酚的降解率達到76.24%。在本文研究中，P4 中游離棉酚的降解率分別為3%、46%和81%(表3)，雖然降解率低于其他文獻中描述的，但其降解率會隨著黑水虻幼蟲數(shù)量的增加而上升。其原因可能是黑水虻幼蟲可以破壞醛基組、羥基組，并鈍化其自由棉酚的化學特性。

黑水虻幼蟲對菜籽粕中的噁唑烷硫酮有明顯的降解作用。梁偉秋等[27]利用植物乳酸菌和曲霉菌發(fā)酵菜籽粕后其噁唑烷硫酮的降解率可達81.82%。傲維平等[28]利用混合菌株發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)其噁唑烷硫酮的降解率為99.99%。這與我們的研究一致，即D4-200 的降解率為99%(表4)。其原因可能是在利用黑水虻幼蟲處理菜籽粕和發(fā)酵菜籽粕的過程中，降低了其甲酰胺酶的含量，從而減少了噁唑烷硫酮的形成。

通過單因素方差分析，黑水虻幼蟲處理豆粕對其總戊聚糖和可溶性戊聚糖的含量沒有顯著影響(P＞0.05)(表2)。相反，黑水虻幼蟲對豆粕中小肽和胰蛋白酶抑制因子的含量影響最大（P＜0.05），同時，小肽和胰蛋白酶抑制因子的標準差為427和87(表2)，這明顯高于其他組的標準差。在用黑水虻幼蟲處理棉籽粕后，其抗營養(yǎng)因子和小肽的含量發(fā)生了顯著改變（P＜0.05）,尤其是小肽和游離棉酚變化最大，其標準偏差分別高達18.48和260(表3)。同樣，菜籽粕中小肽的含量也有顯著變化(P＜0.05)，其標準偏差高達19(表4)。

4 結論

黑水虻幼蟲對未經(jīng)發(fā)酵的豆粕、棉籽粕和菜籽粕中8種主要的抗營養(yǎng)因子具有顯著的降解效果，還能夠顯著增加餅粕原料中小肽的含量。并且隨著黑水虻幼蟲數(shù)量的增加，抗營養(yǎng)因子被祛除的越多，小肽的含量也越多。

豆粕、棉籽粕和菜籽粕在發(fā)酵的同時加入黑水虻幼蟲一起處理，這對餅粕原料中抗營養(yǎng)因子的降解效果將更加明顯，同時其小肽的含量也會大量增加，整體效果高于空白餅粕。

本文中黑水虻幼蟲處理發(fā)酵豆粕、棉籽粕和菜籽粕的最佳比例，即向50 g餅粕中加入200只黑水虻幼蟲。

利用黑水虻幼蟲處理餅粕原料時不需要對發(fā)酵菌種進行復配，也不需要對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，這對一些小型飼料生產(chǎn)廠是提供了理論指導。但是，這種處理方法需要考慮黑水虻幼蟲的添加數(shù)量，以及此種昆蟲飼料對于畜禽的表觀消化、血液生化指標的影響還需要進一步的研究。