陳群英 ，劉振平 ，葉光華 ，范琰琰 ，韓軍鴿

（1.浦江縣公安局刑偵分局，浙江 浦江 322200；2.金華市公安局物證鑒定中心，浙江 金華 321000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，浙江 溫州 325000；4.溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325000）

1 案 例

1.1 簡要案情

某年冬季，在某市景區(qū)附近田間的水塘里發(fā)現(xiàn)一具女性高腐尸體，全身赤裸，雙手腕及雙小腿均被死結(jié)捆綁，軀干背部尼龍繩死結(jié)捆綁四塊磚塊，分析為強奸殺人案。經(jīng)偵查，死者為楊某，23歲，與其男友李某一起租住在該市，二人關(guān)系和睦，李某無作案時間。據(jù)李某交代，在楊某失蹤的兩天前兩人有過性生活。因案發(fā)在田間，案發(fā)處無監(jiān)控視頻，尸體高度腐敗，DNA檢驗成了破案的主要突破口。

1.2 PSA檢驗

參照《人精液PSA檢測金標(biāo)試劑條法》（GA 766—2008）進行陰道拭子的精液斑確證檢驗，結(jié)果為陰性。使用雅培ARCHITECT i2000SR全自動免疫分析系統(tǒng)［雅培貿(mào)易（上海）有限公司］進行前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）定量，結(jié)果為0.471ng/mL。

1.3 DNA提取、擴增及檢測

1.3.1 DNA提取

參照《法庭科學(xué)DNA實驗室檢驗規(guī)范》（GA/T 383—2014）兩步法消化陰道拭子，采用普通硅珠法提取精子DNA，讀取分析實驗結(jié)果后，重新檢驗陰道拭子，第1次消化時間縮短為4 h，充分洗滌后延長第2次消化時間到過夜，消化結(jié)束后采用QIAcube全自動法醫(yī)疑難檢材核酸純化儀（德國QIAGEN公司）進行提取純化，洗脫體系為20μL。

1.3.2 STR擴增

使用AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）、AmpF?STRTMYfilerTMPlus PCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）在ProFlexTMPCR系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）上進行PCR擴增，模板加入5μL，擴增體系及循環(huán)參數(shù)參照說明書，循環(huán)數(shù)均設(shè)置為30次。

1.3.3 檢測

使用3500xL基因分析儀（美國AB公司）進行毛細管電泳，用GeneMapper?ID-X1.4軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行數(shù)據(jù)分析，以等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物為標(biāo)準(zhǔn)進行基因型分型。

1.4 STR分型結(jié)果

兩步法結(jié)合普通硅珠法提取精子DNA，常染色體STR分型檢驗結(jié)果主峰為受害者本人楊某，但個別基因座為混合分型；再進行Y-STR檢驗，結(jié)果與受害者男友李某分型基本一致，僅有1個基因座DYF387S1為疑似混合峰（圖1）。兩步法結(jié)合QIAcube全自動法醫(yī)疑難檢材核酸純化儀的檢驗結(jié)果，常染色體STR檢驗檢出男女性混合DNA分型譜帶（圖2），Y染色體STR檢驗檢出兩男性混合的DNA分型譜帶（圖3）。經(jīng)分析，常染色體STR分型大部分基因座基因型可由受害者楊某與其男友李某混合形成，Y染色體STR分型可由受害者男友李某與另一男性張某混合形成，而另一男性張某應(yīng)該是犯罪嫌疑人。

圖1 兩步法結(jié)合普通硅珠法檢出的Y-STR分型圖譜Fig.1 Y-STR pattern detected by two-step method combined with common silicon bead method

圖2 兩步法結(jié)合QIAcube全自動法醫(yī)疑難檢材核酸純化儀檢出的常染色體STR分型圖譜Fig.2 Two-step method combined with QIAcube automatic forensic difficult samples STR pattern detected by nucleic acid purifier

圖3 兩步法結(jié)合QIAcube全自動法醫(yī)疑難檢材核酸純化儀檢出的Y-STR分型圖譜Fig.3 Y-STR typing map detected by two-step method combined with QIAcube automatic nucleic acid purifier for difficult forensic samples

2 討 論

人類Y染色體是正常男性擁有而女性沒有的性染色體，具有父系遺傳特點，Y染色體屬近端著絲粒染色體，長度約60Mb。Y-STR是存在于人類Y染色體男性特異區(qū)上的短串聯(lián)重復(fù)序列，呈單倍型，在排除突變的情況下，同一父系個體Y-STR分型一致，不同父系個體Y-STR分型不同。在男女混合樣本的檢測中，Y-STR的靈敏度與常染色體STR相比具有明顯優(yōu)勢[1-2]。Y染色體排除干擾法即根據(jù)上述原理，通過分析Y-STR分型，對混合樣本中男女性成分及不同父系來源男性個體進行甄別，從而縮小排查范圍，加快案件偵破。當(dāng)前，Y-STR分型技術(shù)被廣泛用于法醫(yī)學(xué)實踐[3-4]。本案通過女、男、男混合斑跡的檢驗結(jié)果分析，運用Y染色體排除干擾法幫助案件偵破。由于受到混合成分的種類、混合個體數(shù)以及不同個體來源的成分所占比例等因素的影響，混合斑檢驗結(jié)果的分析較單一斑跡復(fù)雜得多[5]。本案混合斑的鑒定，因樣本受到水中浸泡、稀釋以及腐敗的影響，檢驗難度大，無法通過對比類推法[6]直接檢測出陰道混合斑遺傳標(biāo)記的所有分型。又因個體成分比例懸殊，女性成分占有絕對優(yōu)勢，而且本案楊某與李某最后一次性生活發(fā)生在楊某失蹤的兩天前，陰道混合斑李某精液量減少。據(jù)案件偵破后張某交代，其因心情緊張、時間倉促，只有部分精液射于楊某陰道中，加之環(huán)境影響，距案發(fā)時間較久，精液量銳減，無法分離精液與陰道液組分。所以采用Y-STR分型技術(shù)，不斷改進實驗方法，在常規(guī)方法未獲得理想檢測結(jié)果后，重新提取死者陰道拭子，縮短第1次消化時間以減少精子細胞的損耗，延長第2次消化時間充分消化精子細胞，再利用核酸純化儀增加精子DNA回收率，最終檢測出混合斑中精液特有成分。

本案最初采用普通硅珠法進行精子DNA提取，未檢出理想的男性DNA分型，但是考慮到死者全身赤裸，有性侵可能，且PSA定量為0.471ng/mL，分析可能存在其他男性DNA分型，于是重新提取，優(yōu)化檢驗方法，結(jié)果常染色體STR分型檢驗檢出男女性混合DNA分型，但以女性成分為主，而Y-STR分型檢驗檢出兩名男性混合DNA分型，二者體現(xiàn)明顯的主要成分和次要成分關(guān)系。據(jù)文獻[7]報道，當(dāng)混合樣本中小比例個體成分不足4%時，由于DNA量少而不能檢出。本案中常染色體STR分型表現(xiàn)為兩人混合，假設(shè)該模板中包含除受害人男友外的其他男性，且該男性模板量少于模板總量的4%，則常染色體分型無法體現(xiàn)。為進一步分析該模板中是否有第三人，本案使用AmpF?STRTMYfilerTMPlus PCR擴增試劑盒檢測，最終檢出兩男性混合Y-STR分型。經(jīng)大量排查人員的數(shù)據(jù)比對，最終得出該混合分型可由受害者男友李某與嫌疑人張某混合形成的結(jié)論，為案件破獲提供了重要線索。

綜上，對該案件予以總結(jié)以供同行借鑒：（1）與PSA膠體金試劑條相比，PSA定量分析靈敏度更高，本案為浸泡水中10余天呈高度腐敗的尸體，其陰道拭子金標(biāo)試劑條法檢驗結(jié)果為陰性，但PSA定量結(jié)果為0.471 ng/mL。因此在日常檢案中，精液斑的DNA提取不能完全依據(jù)PSA膠體金試劑條的檢驗結(jié)果，應(yīng)結(jié)合案情綜合考慮是否必要進行后續(xù)實驗。（2）常規(guī)方法提取精子DNA，由于精子DNA量少未檢出男性DNA分型時，應(yīng)改變提取方法提高精子DNA回收率。本案多次采用常規(guī)硅珠法提取精子DNA失敗，改用核酸純化儀提取方法后，檢出嫌疑人DNA分型。（3）“當(dāng)混合樣本中小比例個體成分不足4%時，由于DNA量少而不能檢出”，該原則同樣適合于三人混合（女、男、男）DNA分析。當(dāng)檢測圖譜表現(xiàn)為男女混合STR分型，但案情支持可能有其他男性時，應(yīng)進行Y-STR檢測來排除女性干擾，當(dāng)模板中不同男性比例小于20∶1，量少的一方能夠在Y-STR圖譜中體現(xiàn)[8]。如本案嫌疑人DNA分型在常染色體STR分型圖譜中未體現(xiàn)出來，而在Y-STR圖譜中卻得以體現(xiàn)。