林錦鋒，魏莎莎，馬克

（1.寧波市公安局，浙江 寧波 315000；2.上海市刑事科學技術(shù)研究院，上海 200083）

1 案 例

1.1 簡要案情

某日，1具無名尸體經(jīng)DNA檢驗確認，乃王大某同母異父的半同胞兄弟王小某。

1.2 檢驗方法

1.2.1 DNA提取

通過靜脈采血得到王大某血液樣本2mL，通過采集心血得到王小某血液樣本2mL。使用常規(guī)Chelex-100法提取DNA。

1.2.2 常染色體STR基因座檢測

分別采用AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）和21+1試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）對2份血液樣本進行常染色體STR基因組和Amelogenin性別基因座的分型檢測。擴增體系、擴增程序均按照相應的產(chǎn)品說明書進行，擴增反應采用9700型PCR儀（美國AB公司）。擴增產(chǎn)物采用3500xL基因分析儀（美國AB公司）電泳后，采用GeneMapper?IDV3.2軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 Y染色體STR基因座檢測

采用YfilerTMPlus PCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）對上述2份血液樣本進行Y染色體STR基因座分型。依據(jù)試劑盒使用說明進行擴增、電泳和結(jié)果分析。

1.2.4 線粒體DNA（mtDNA）全序列分析

2份血樣采用Precision ID mtDNA Whole Genome Panel（美國Thermo Fisher Scientific公司）擴增獲取樣本的mtDNA全序列，采用Precision ID Library試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）和Ion XpressTMBarcode Adapters試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）完成文庫構(gòu)建，完成定量后利用Ion TorrentTM測序平臺（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行測序反應，共設置500個測序循環(huán)。測序結(jié)果采用配套的Torrent Suite V4.2.1軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）對信號進行捕獲和轉(zhuǎn)換，并結(jié)合Variant Caller 4.2（美國QIANEN公司）和Integrative Genomics Viewer（美國加利福尼亞大學博大研究所）軟件進行初步分析，以修訂后的劍橋參考序列（rCRS，NC_012920.1）[1]為參照標準。

1.2.5 同胞關系指數(shù)的計算

采用ITO法[2]計算王大某和被鑒定人之間的全同胞指數(shù)（full sibling index，F(xiàn)SI）、半同胞指數(shù)（half sibling index，HSI）以及全同胞指數(shù)與半同胞指數(shù)的比值（FSI∶HSI）。

1.3 檢測結(jié)果

1.3.1 染色體STR鑒定結(jié)果

AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴增試劑盒共檢測了15個常染色體STR基因座和Amelogenin性別基因座（表1）。經(jīng)過ITO法計算后，兩人的全同胞FSI值為18.29，半同胞HSI值為43.66，IBS計算結(jié)果為14。YfilerTMPlus PCR擴增試劑盒共檢測了25個Y染色體STR基因座（表2）。21+1試劑盒檢測結(jié)果見表3。其中D19S443位點為兩個試劑盒共有位點，因此兩個試劑盒共檢測了35個常染色體STR和1個性別基因座。加做位點之后按照ITO法計算兩人全同胞FSI值為13 633.4，半同胞HSI值為20 499.7，IBS計算結(jié)果為25。

1.3.2 mtDNA全序列測定結(jié)果

mtDNA的全測序是采用316 V2芯片在Ion TorrentTM測序平臺上完成的，芯片的有效區(qū)域為65%，文庫連接率為100%。除去19%的多克隆、20%的低質(zhì)量文庫，最終可用文庫為63%，共獲取2.5×106個測序片段，平均讀長為127 bp，最終的測序數(shù)據(jù)總量為321Mbp。通過數(shù)據(jù)分析后，兩例樣本mtDNA均檢測到35個SNP突變，且2例樣本突變位點一致，根據(jù)線粒體進化樹進行分析，2例樣本均屬于D4s單倍群。

表1 AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴增試劑盒分型結(jié)果Tab.1 AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR amplification kit typing results

表2 YfilerTMPlus PCR擴增試劑盒分型結(jié)果Tab.2 YfilerTMPlus PCR amplification kit typing results

表3 21+1試劑盒分型結(jié)果Tab.3 21+1 kit typing results

1.3.3 鑒定意見

經(jīng)多種遺傳標記（常染色體STR、Y染色體STR、mtDNA）檢測結(jié)果相互驗證和補充，綜合分析，推斷出王大某和被鑒定人為同母異父的半同胞關系。

2 討 論

刑事案件中，尸源認定對案件的偵破起到關鍵性作用。本案中，查明被鑒定人身份是案件偵破的首要因素，在大規(guī)模的摸排過程中，常染色體STR位點分析發(fā)現(xiàn)王大某和被鑒定人有11個位點一致（AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴增試劑盒），引起了檢案人員的高度重視，懷疑被鑒定人可能是王大某的兄弟王小某。為了增加鑒定效能，加做了YfilerTMPlus PCR擴增試劑盒和21+1試劑盒，并分別采用IBS和ITO法計算二人的血緣關系。IBS和ITO法都是計算個體間血緣關系的經(jīng)典方法，可用于半同胞、全同胞、無關個體關系鑒定，使用范圍廣，相較于IBS算法而言，ITO算法在計算時考慮了不同等位基因的人群頻率等，使得計算結(jié)果更加精確[3-4]。本案例采用ITO算法進行計算。AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴增結(jié)果按照ITO法計算后兩人的全同胞FSI值為18.29，半同胞HSI值為43.66，F(xiàn)SI∶HSI值明顯小于1，IBS計算結(jié)果為14。加做位點之后按照ITO法計算兩人35個位點的全同胞FSI值為13633.4，半同胞HSI值為20499.7，F(xiàn)SI∶HSI值依舊小于1，IBS計算結(jié)果為25。因此傾向于王大某和被鑒定人屬于半同胞關系。在全同胞-半同胞的鑒定中，F(xiàn)SI和HSI的比值是比較合適的定量指標。陸惠玲等[5-6]對日常鑒定積累的1050個樣本，通過15個常染色體STR基因座分型結(jié)果在ITO法基礎上建立了鑒定全同胞和半同胞的方法，指出FSI∶HSI≥1與FSI∶HSI＜1可分別作為全同胞與半同胞的判別標準。隨后本研究采用YfilerTMPlus PCR擴增試劑盒共檢測了25個Y染色體STR基因座，兩人共有23個Y-STR位點不一致，因此排除二人來源于同一父系的可能性。此外，我們通過高通量測序的方法對王大某和被鑒定人的mtDNA進行了全序列的測定，mtDNA的序列多態(tài)性可以作為母系關系鑒定的重要參考遺傳標記。高通量測序技術(shù)能夠得到更多的線粒體遺傳信息，通過和劍橋序列比對，兩例樣本共享35個mtDNA SNP位點。其中有7個位點位于高變區(qū)，28個位點位于非高變區(qū)，相比于以往只檢測線粒體的高變區(qū)，采用Ion TorrentTM測序平臺可以額外提供多達400%的堿基變異信息，可以幫助識別控制區(qū)測序檢驗無法鑒別的樣本，從而提高mtDNA的個體識別能力。此外，王大某父母均已過世，給同胞鑒定工作帶來一定的難度，我們結(jié)合了常染色體STR、Y染色體STR和mtDNA全測序等技術(shù)手段，運用各種遺傳標記和計算方法以相互驗證、支持，得出了被鑒定人為王大某同母異父的半同胞兄弟。

本案例提示，在尸源查找過程中，要注意檢測結(jié)果，對可疑對象要盡可能采用多種遺傳標記進行共同驗證。此外，隨著社會發(fā)展，涉及復雜親緣關系鑒定的案例也越來越多，案情的復雜性和風險性也隨之增高，目前尚無針對半同胞關系鑒定的指南或者行業(yè)標準頒布[7]，需要我們在實際鑒定過程中注意甄別和核實，通過多種遺傳標記的綜合應用才能夠獲得有效且準確的鑒定結(jié)果。