趙振宇

摘要：目的? 探討miR-33表達(dá)與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。方法? 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人單核細(xì)胞（THP-1）48～72 h后傳代，傳至3代，加入100 ng/ml佛波醇（PMA）誘導(dǎo)24 h分化成為巨噬細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度LPS（0、1、10、100 ng/ml）以及10 ng/ml LPS不同刺激時(shí)間（0、24、36、48 h）THP-1巨噬細(xì)胞miR-33表達(dá);另采用ELISA法檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6和MCP-1表達(dá)量，分析miR-33表達(dá)與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。結(jié)果? 隨著LPS濃度（0、1、10、100 ng/ml）增加，miR-33表達(dá)、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加，不同濃度組miR-33表達(dá)、TNF-α、IL-6和MCP-水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著LPS刺激時(shí)間（0、24、36 h）延長(zhǎng)，miR-33表達(dá)逐漸上調(diào)、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加，36 h達(dá)到高峰，48 h逐漸下降到正常，不同時(shí)間點(diǎn)miR-33表達(dá)、TNF-α、IL-6和MCP-1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-33表達(dá)與TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論? THP-1細(xì)胞中miR-33表達(dá)與其炎癥反應(yīng)具有一定正相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：內(nèi)毒素脂多糖;微小RNA;炎癥因子;單核細(xì)胞;膿毒癥

中圖分類號(hào)：R631;Q291? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.02.020

文章編號(hào)：1006-1959（2020）02-0073-03

Abstract：Objective? To investigate the correlation between miR-33 expression and inflammatory response. Methods? Human mononuclear cells （THP-1） were cultured in a cell culture incubator for 48 to 72 h and then passaged to passage 3， and 100 ng / ml phorbol （PMA） was added to induce macrophage differentiation for 24 h.Detection of THP-1 macrophages miR-33 at different concentrations of LPS （0，1，10，100 ng/ml） and 10 ng/ml LPS at different stimulation times （0，24，36，48 h） using real-time PCR expression; ELISA was used to detect the expression of TNF-α， IL-6 and MCP-1 in THP-1 macrophages， and the correlation between miR-33 expression and inflammatory response was analyzed.Results? With the increase of LPS concentration （0，1，10，100 ng/ml）， the expression of miR-33， TNF-α， IL-6 and MCP-1 levels gradually increased. There were statistically significant differences in miR-33 expression， TNF-α， IL-6 and MCP- levels in different concentration groups（P<0.05）.With the extension of LPS stimulation time（0，24，36 h）， miR-33 expression gradually increased， TNF-α， IL-6 and MCP-1 levels gradually increased， peaked at 36 hours， and gradually decreased to normal at 48 h. There were statistically significant differences in miR-33 expression， TNF-α， IL-6 and MCP-1 levels at time points（P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that miR-33 expression was positively correlated with TNF-α， IL-6 and MCP-1（P<0.05）.Conclusion? The expression of miR-33 in THP-1 cells has a positive correlation with its inflammatory response.

Key words：Endotoxin lipopolysaccharide;MicroRNA;Inflammatory factors;Monocytes;Sepsis

膿毒癥（sepsis）是一種由細(xì)菌、病毒、真菌及寄生蟲等各種病原微生物感染引起的全身性炎癥反應(yīng)，其本質(zhì)是機(jī)體促炎性介質(zhì)過(guò)度釋放引起炎癥反應(yīng)失控，導(dǎo)致自身免疫性病理?yè)p傷，嚴(yán)重時(shí)可以發(fā)展為多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]。膿毒癥臨床治療效果不佳、費(fèi)用高昂，預(yù)后差，已成為重癥監(jiān)護(hù)室非心臟病患者死亡的主要原因。近年來(lái)基于膿毒癥的病理生理，臨床采用了單克隆抗體來(lái)中和TNF-α、IL-6和MCP-1等炎癥因子新型生物療法，但其治療效果并不理想，因此有效預(yù)防、早期診斷及積極治療膿毒癥意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種廣泛分布于真核細(xì)胞內(nèi)以及病毒中，長(zhǎng)度約為20～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子[2，3]。有研究表明[4，5]，miR-33a可以調(diào)控人外周血單核巨噬細(xì)胞靶基因ABCA1的表達(dá)，參與機(jī)體脂質(zhì)代謝，介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成。THP-1單核細(xì)胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，而目前miR-33與THP-1細(xì)胞炎癥相關(guān)研究較少。本研究主要探討miR-33與TNF-α、IL-6及MCP-1表達(dá)水平的相關(guān)性，旨在探討其在膿毒血癥進(jìn)展中的意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑? 研究時(shí)間：2019年2～3月。細(xì)胞：THP-1（中科院細(xì)胞生物所細(xì)胞中心）;脂多糖（LPS;Sigma，美國(guó)）;DMEM培養(yǎng)基、改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）。試劑：TNF-α、MCP-1、IL-6 Human ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組? 細(xì)胞培養(yǎng)：THP-1細(xì)胞于改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h后傳代，傳至3代，PI單染色法檢測(cè)THP-1細(xì)胞存活率。將處于對(duì)數(shù)期THP-1單核細(xì)胞以密度為1×106/ml種植于6孔板中，每孔鋪細(xì)胞懸液2 ml，并用100 ng/ml佛波酯（PMA）誘導(dǎo)24 h分化成貼壁的巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組：①THP-1巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別用不同濃度的LPS（0、1、10、100 ng/ml）誘導(dǎo)各組細(xì)胞24 h。②THP-1巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為4組，濃度為10 ng/ml LPS誘導(dǎo)各組細(xì)胞不同時(shí)間（0、24、36、48 h）。

1.3方法

1.3.1 miR-33表達(dá)? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-33表達(dá)：使用TRIzol法提取各組細(xì)胞沉淀中總RNA，紫外線分光光度定量，RNA/DNA微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度。按Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄。cDNA合成過(guò)程采用miR-33s RT特異性構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄體系，miR-33 RT引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACUUCACG-3';內(nèi)參照U6 RT引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。miR-33 PCR擴(kuò)增條件為：95℃，30 min;40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95℃ 8 s，64℃ 10 s，72℃ 20 s）。miR-33正向引物序列：5'-GGTTAGATCTTGCTCCAGCGGTTTG-3';反引物序列：5'-GTAAAGCTTGCCCTCCTGTTTCCTG-3'。內(nèi)參照U6正向引物序列：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3';反向引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，相關(guān)引物序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。miR-33以U6為內(nèi)參基因，相對(duì)定量用2-ΔΔCt計(jì)算，Ct值為目的基因達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR循環(huán)次數(shù)，目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的相對(duì)數(shù)△△Ct=（Ct靶基因-Ct內(nèi)參）處理組-（Ct靶基因-Ct內(nèi)參）未處理組。

1.3.2 TNF-α、IL-6和MCP-1表達(dá)水平? 收集各組細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6和MCP-1含量，嚴(yán)格按照Human ELISA試劑盒內(nèi)說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)操作。

1.4觀察指標(biāo)? 比較不同濃度組（0、1、10、100 ng/ml）中miR-33表達(dá)及TNF-α、IL-6和MCP-1水平，不同時(shí)間組（0、24、36、48 h）中miR-33表達(dá)及TNF-α、IL-6和MCP-1水平，并分析miR-33與TNF-α、IL-6和MCP-1表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析miR-33與TNF-α、IL-6和MCP-1表達(dá)水平的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度組中miR-33表達(dá)比較? 隨著LPS濃度（0、1、10、100 ng/ml）增加，miR-33表達(dá)逐漸增加，不同濃度組中miR-33表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2不同濃度組中TNF-α、IL-6和MCP-水平比較? 隨著LPS濃度（0、1、10、100 ng/ml）增加，TNF-α、IL-6和MCP-1水平增加，不同濃度組中TNF-α、IL-6和MCP-水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3不同時(shí)間組中miR-33表達(dá)比較? 隨著LPS刺激時(shí)間（0、24、36 h）延長(zhǎng)，miR-33表達(dá)逐漸上調(diào)，36 h達(dá)到高峰，48 h逐漸下降到正常，不同時(shí)間組中miR-33表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.4不同時(shí)間組中TNF-α、IL-6和MCP-1水平比較? 隨著LPS刺激時(shí)間（0、24、36 h）延長(zhǎng)，TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加，36 h達(dá)到高峰，48 h下降到正常水平，不同時(shí)間組中TNF-α、IL-6和MCP-1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.5 miR-33與TNF-α、IL-6和MCP-1表達(dá)水平相關(guān)性分析? miR-33表達(dá)與TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相關(guān)（r=0.873、0.782、0.915，P<0.05）。

3討論

膿毒癥與全身過(guò)度炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，免疫細(xì)胞激活、轉(zhuǎn)錄因子活化、炎癥因子過(guò)度釋放，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是其發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制[6]。大量炎癥介質(zhì)的釋放是導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征的“中心環(huán)節(jié)”，其中IL-6和TNF-α作為快速反應(yīng)炎癥因子，是啟動(dòng)“瀑布樣反應(yīng)”最上游的炎癥介質(zhì)，一定程度上反應(yīng)了病情程度以及預(yù)后[7，8]。

miRNA根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過(guò)與靶基因mRNA3'末端非翻譯區(qū)特異性結(jié)合降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。研究表明[9]，在膿毒血癥發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，多種miRNA（miRNA-346、miRNA-147、miRNA-142-3p、miRNA-155、miRNA-9）參與了致炎基因表達(dá)的調(diào)控，從而影響炎癥細(xì)胞的增殖分化以及炎癥因子的產(chǎn)生釋放。本研究結(jié)果表明，隨著LPS濃度（0、1、10、100 ng/ml）增加，miR-33表達(dá)、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加，不同濃度組中miR-33表達(dá)、中TNF-α、IL-6和MCP-水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明LPS能夠誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞miR-33以及TNF-α、IL-6和MCP-1的表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。隨著LPS刺激時(shí)間（0、24、36 h）延長(zhǎng)，miR-33表達(dá)逐漸上調(diào)、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加表達(dá)逐漸上調(diào)，36 h達(dá)到高峰，48 h逐漸下降到正常，不同時(shí)間組中miR-33表達(dá)、TNF-α、IL-6和MCP-1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明LPS能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞miR-33以及TNF-α、IL-6和MCP-1的表達(dá)，并具有時(shí)間依賴性。Pearson相關(guān)分析顯示，miR-33表達(dá)與TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相關(guān)（P<0.05），說(shuō)明miR-33可能參與調(diào)節(jié)THP-1細(xì)胞TNF-α、IL-6和MCP-1的表達(dá)。

綜上所述，miR-33可能參與了THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)調(diào)控，其具體機(jī)制還有待一步研究。

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收稿日期：2019-11-20;修回日期：2019-11-28

編輯/杜帆