謝 燕 付元帥 施志儀 季文瑤 陶家康

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

牙鲆Paralichthys olivaceusTemminck & Schlegel屬于鰈形目, 在仔魚向稚魚的胚后發(fā)育中經(jīng)歷劇烈的變態(tài)過(guò)程, 表現(xiàn)為右眼左移、體位從側(cè)臥變?yōu)槠脚P、浮游轉(zhuǎn)為底棲生活等。甲狀腺激素(Thyroid Hormone, TH)在鰈形目魚類變態(tài)過(guò)程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用[1—3], 直接控制著仔魚變態(tài)的進(jìn)程。T3(3, 3′, 5-triiodo-L-thyronine,三碘甲狀腺原氨酸)是TH發(fā)揮生理作用的主要形式。TH是通過(guò)甲狀腺激素受體(Thyroid Hormone Receptors, TRs)和非甲狀腺激素受體發(fā)揮作用[4,5]。甲狀腺激素受體屬于核受體超家族中的一員, 是配體T3誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子, 在介導(dǎo)T3的作用過(guò)程中處于核心地位, 通過(guò)招募多種共激活子或共抑制子來(lái)實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄的激活或抑制。TRs分子在結(jié)構(gòu)上分為6個(gè)區(qū), 從氨基端到羧基端依次為A-F區(qū), 組成3個(gè)功能域: 轉(zhuǎn)錄激活域AF-1(A/B區(qū)), DNA結(jié)合域DBD(C區(qū)), 鉸鏈區(qū)(D區(qū)), 配體結(jié)合域LBD(E區(qū))[6,7]。TRs與維甲酸X受體(Retinoid X receptors)及其他核受體形成異二聚體結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲狀腺激素應(yīng)答元件上(Thyroid Hormone Response Elements,TREs), 從而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[8,9]。TREs通常包含兩個(gè)或更多個(gè)串聯(lián)排列的六聚體半位序列AGGT(C/A)A[10], 具有3種識(shí)別類型[11]: 回文結(jié)構(gòu)(Palindrome, AGGTCATGACCT, 如生長(zhǎng)激素Ⅰ即Gh1)、直接重復(fù)(Direct Repeat, 最常見DR4類型, AGGTCANNNNAGGTCA, 如kruppel-like因子9即Klf9)和倒置回文結(jié)構(gòu)(Everted Repeat, 最常見6 bp間隔,TGACCTNNNNNNAGGTCA, 如髓磷脂堿性蛋白即myelin basic protein, Mbp)。牙鲆含有TRαA、TRαB和TRβ三種受體, TR亞型(TRαA、TRαB和TRβ1、TRβ2)在牙鲆變態(tài)期間基因表達(dá)具有時(shí)間特異性和組織特異性:TRαA在變態(tài)高峰期急劇增加,高峰期后又迅速下降;TRαB在仔魚發(fā)育整個(gè)過(guò)程中都很低;TRβs的表達(dá)水平在變態(tài)高峰增加, 于變態(tài)高峰后達(dá)到峰值, 高水平的TRβs在變態(tài)完成的稚魚中尚在持續(xù)[3,12,13]。

那么TH是如何調(diào)控牙鲆仔魚的變態(tài)? 鑒定出TRs直接調(diào)控的靶基因是一個(gè)關(guān)鍵。通過(guò)牙鲆轉(zhuǎn)錄組及基因組TRE數(shù)據(jù)庫(kù)篩選, 結(jié)合生物信息學(xué)分析,初步確定候選靶基因atoh8(Gene ID:109627718)。atoh8(Atonal homolog 8, atonal bHLH transcription factor 8), 屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)轉(zhuǎn)錄因子, 參與斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞和體節(jié)肌肉細(xì)胞的發(fā)育分化, 在視網(wǎng)膜和體節(jié)發(fā)育的調(diào)控過(guò)程中,atoh8起著不可或缺的重要作用[14]。關(guān)于atoh8與甲狀腺激素調(diào)控通路的關(guān)系尚未見報(bào)道。

本研究克隆了牙鲆TRαA基因及atoh8基因5′-側(cè)翼序列各缺失片段, 并成功構(gòu)建p3×Flag-TRαA和pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708(含候選靶基因5′-側(cè)翼序列的缺失片段), 通過(guò)在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染p3×Flag-TRαA和pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn), 分別探究不同的5′-側(cè)翼序列長(zhǎng)度和對(duì)同一5′-側(cè)翼序列進(jìn)行不同處理(TRαA和T3都不加、只加TRαA或同時(shí)加TRαA與T3)對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響, 以期鑒定出TRαA受體是否結(jié)合在atoh8基因5′調(diào)控區(qū)特異的TRE序列來(lái)調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄并判別具體是哪個(gè)TRE位點(diǎn)起到了關(guān)鍵作用, 最終鑒定出atoh8是否為TRαA介導(dǎo)甲狀腺激素調(diào)控的直接靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

出膜后20d (20dph,days post hatching)、28d(28dph)的牙鲆仔魚, 采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站; HEK293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。DMEM、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、0.25%胰酶-EDTA購(gòu)自Gibco; 細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海威奧; 一抗Anti-Flag Tag (1E6) Monoclonal Antibody (GNI4110-FG)購(gòu)自上海睿星, 二抗HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG (D110087)、5×蛋白質(zhì)加樣緩沖液、平端 DNA 片段添dA試劑盒購(gòu)自上海生工, 引物合成由上海生工完成; BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì), Anti-DYKDDDDK G1 Affinity Resin和DYKDDDDK Peptide購(gòu)自金斯瑞; DNaseI、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)于Promega; 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自YEASEN,EcoRⅠ、KpnⅠ-HF、XhoⅠ限制酶、T4 DNA Ligase購(gòu)自NEB; X-gal、IPTG購(gòu)自天根, 2 × Phanta Max Master Mix購(gòu)自Vazyme, pEASY?-T5 Zero購(gòu)自全式金,DH5α購(gòu)自上海唯地; TaKaRa LATaq、pMD19-T、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)購(gòu)自TaKaRa, 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega。p3×Flag、pGL3-Basic載體由上海海洋大學(xué)李名友教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄將28dph仔魚按照Trizol?Reagent(Invitrogen)試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。檢測(cè)總RNA純度、濃度和完整性[15], 均符合要求后置于-80℃保存; 將上述RNA用DNaseⅠ處理后, 按Su等[16]方法反轉(zhuǎn)錄, 產(chǎn)物cDNA用于PCR擴(kuò)增或-20℃保存。

牙鲆TRαA基因CDS區(qū)的克隆從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取牙鲆TRαA基因序列(Gene ID: 109641414), 根據(jù)其序列和p3×Flag多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物TRαA1252-F/R(表 1), 以上述cDNA為模板, 通過(guò)2×Phanta Max Master Mix擴(kuò)增CDS區(qū)全長(zhǎng)。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳, 膠回收純化目的片段, 加A, 連接至pEASY?-T5 Zero, 轉(zhuǎn)化DH5α。挑取陽(yáng)性單克隆, 經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證有大小正確的片段插入后測(cè)序, 交由上海生工完成。

重組真核表達(dá)載體p3×Flag-TRαA的構(gòu)建將上述測(cè)序正確的菌液和p3×Flag擴(kuò)大培養(yǎng)提質(zhì)粒;用EcoRⅠ、KpnⅠ37℃雙酶切; 將鑒定正確的酶切PCR產(chǎn)物與p3×Flag載體分別進(jìn)行膠回收, 產(chǎn)物按摩爾比3∶1經(jīng)T4 DNA Ligase 16℃連接16h; 轉(zhuǎn)化DH5α, 挑取陽(yáng)性單克隆, 搖菌提質(zhì)粒, 雙酶切驗(yàn)證,再送上海生工測(cè)序驗(yàn)證; 將鑒定正確的p3×Flag-TRαA擴(kuò)大培養(yǎng), 提取不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒。

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS-DMEM 培養(yǎng)液中, 置于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng), 轉(zhuǎn)染前一天接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板1.5 mL不含抗生素的10% FBSDMEM中, 轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為90%—95%。配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物[3 μg p3×Flag-TRαA(實(shí)驗(yàn)組)或p3×Flag(陰性對(duì)照), 7.5 μL FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑, 無(wú)抗生素、無(wú)血清DMEM補(bǔ)至500 μL], 混勻后室溫孵育10—15min, 加到6孔板相應(yīng)孔中, 未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒作為空白對(duì)照, 每組(未轉(zhuǎn)、空載、重組質(zhì)粒)設(shè)4個(gè)重復(fù), 一組用于總蛋白提取, 其余3組用于總RNA提取。培養(yǎng)6h左右換完全培養(yǎng)基, 48h后進(jìn)行總蛋白和總RNA提取。

TRαA基因的RT-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)將上文中RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, PCR擴(kuò)增TRαA基因CDS區(qū)全長(zhǎng)與18S定量?jī)?nèi)參基因。在CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)上分別制作目的基因TRαA和內(nèi)參基因18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 在符合要求后, 隨后定量分析所有樣品。反應(yīng)體系(20 μL): 1 μL cDNA, 各1 μLTRαA-qF/R或18S-qF/R (表 1), 10 μL TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)和7.0 μL DEPC水; 反應(yīng)條件:95℃ 3min; 95℃ 10s, 60℃ 30s, 采集熒光40次。該實(shí)驗(yàn)中, 生物學(xué)重復(fù)n=3, 技術(shù)重復(fù)2次。

表 1 TRαA基因的擴(kuò)增和定量引物Tab. 1 The primer used for cloning and real time quantitative PCR of TRαA gene

TRαA的mRNA相對(duì)表達(dá)量通過(guò)2-ΔΔCt[17]方法計(jì)算, 其結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)來(lái)表示(n=3)。通過(guò)SigmaPlot 12.0軟件作圖分析,利用SPSS 22軟件中的One-Way ANOVA方差分析法分析不同樣品間的相對(duì)表達(dá)差異, *P＜0.05時(shí)表示差異顯著。

Western blot檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)按上文方法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞, 經(jīng)PBS洗2次, 1000 r/min離心5min分類收集HEK293T細(xì)胞; 加入預(yù)冷含PMSF (裂解液∶PMSF=99∶1)的細(xì)胞裂解液, 現(xiàn)配現(xiàn)用, 混勻后冰上輕微搖晃10min; 4℃、13000 r/min離心5min, 取上清, 分裝使用或-80℃凍存。參考說(shuō)明書用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

分別吸取上述蛋白樣品10 μg, 裂解液補(bǔ)至20 μL,加入5×SDS-PAGE加樣緩沖液5 μL 100℃干式恒溫10min, -20℃保存或加樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 將分離的蛋白條帶電轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上, TBST洗2次(每次10min, 下述一樣); 再將 PVDF 膜浸于含5%脫脂奶粉的TBS中室溫封閉1h, TBST洗2次; 按1∶1000用TBS稀釋一抗(小鼠抗Flag標(biāo)簽單抗)4℃孵育過(guò)夜, TBST洗3次; 按1∶5000用TBST稀釋二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG)37℃孵育1h, TBST洗3次; 將PVDF膜與ECL發(fā)光液避光充分接觸1min, 在暗室X光片下曝光拍照。

融合蛋白3×Flag-TRαA的純化采用T25瓶整瓶細(xì)胞轉(zhuǎn)染, 且質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比為4 μg∶8 μL,按上述方法收集細(xì)胞提取總蛋白。目的蛋白TRαA的N端融合有3×Flag標(biāo)簽, 通過(guò)G1親和層析柱純化后, 分別保留總蛋白原液、流出液、洗雜液和洗脫液, 洗脫液經(jīng)無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌后, -80℃保存,Western blot檢測(cè)純化效果。

TRαA直接調(diào)控候選靶基因的篩選與重組報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-Pro-atoh8的構(gòu)建 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(正常樣品, 甲狀腺素處理樣品)篩查, 及基于現(xiàn)有上傳的牙鲆基因組建立的TRE數(shù)據(jù)庫(kù)篩選, 結(jié)合TREs識(shí)別類型, 從NCBI中獲取牙鲆候選靶啟動(dòng)子5′-側(cè)翼序列, 利用在線網(wǎng)站http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html, http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/, https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/, http://biogrid-lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/等預(yù)測(cè)靶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。初步確定候選靶啟動(dòng)子, 如atoh8(Gene ID:109627718)。

采用苯酚抽提法從20dph仔魚中提取基因組DNA。根據(jù)atoh8基因5′-側(cè)翼序列和pGL3-Basic多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì)引物(表 2), 固定下游引物, 改變上游引物以缺失預(yù)測(cè)出的TRE位點(diǎn), 以基因組DNA為模板, 經(jīng)TaKaRa LATaq擴(kuò)增先得到atoh8啟動(dòng)子最長(zhǎng)的缺失片段。

按上述方法(產(chǎn)物連至pMD19-T, 用KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切, 酶切PCR產(chǎn)物和pGL3載體4℃連接過(guò)夜)獲得pGL3-Pro-atoh8-1517。再以pGL3-Proatoh8-1517為模板, 按如上方法獲得pGL3-Proatoh8-1333/708。

表 2 候選靶啟動(dòng)子各缺失片段的擴(kuò)增引物Tab. 2 The primer used for cloning each missing fragment of the candidate target promoter

雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)參考前文方法將HEK293T細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物[10 ng內(nèi)參質(zhì)粒 phRL-TK, 100 ng空載pGL3-Basic或100 ng重組質(zhì)粒pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708(或含100 ng重組質(zhì)粒p3×Flag-TRαA),0.22 μL FuGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑, 無(wú)抗生素、無(wú)血清DMEM補(bǔ)至10 μL], 混勻后室溫孵育10—15min,加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板相應(yīng)孔中, 繼續(xù)培養(yǎng), 6h后換完全培養(yǎng)基, 再 24h后向轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中加入0.1 μL T3(終濃度為150 ng/μL), 再24h后檢測(cè)并計(jì)算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的比值, 每個(gè)轉(zhuǎn)染組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔, 重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 12.0作圖, 并通過(guò)SPSS 22軟件中的單因素方差分析“一般線性模型”-“單變量”和LSD進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析, 當(dāng)*P＜0.05時(shí)接受差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆TRαA基因CDS區(qū)的克隆和p3×Flag-TRαA的構(gòu)建

以28dph牙鲆仔魚 cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果顯示片段大小約為1.2 kb, 與NCBI上傳(XM_020105869.1)的大小相一致; 實(shí)際擴(kuò)增得到片段大小是1252 bp, 并成功構(gòu)建了p3×Flag-TRαA重組質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果顯示CDS區(qū)第850個(gè)核苷酸穩(wěn)定由A突變?yōu)镚, 導(dǎo)致氨基酸由Ser轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly; 920—1030 bp有兩小段, 分別是連續(xù)9 bp、連續(xù)11 bp與NCBI上傳序列始終不同, 且不同的高保真酶擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果相同。

2.2 牙鲆TRαA基因推導(dǎo)氨基酸序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)平臺(tái), 分析TRαA基因編碼序列所推導(dǎo)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì), 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為47 kD, 理論等電點(diǎn)是7.06。Leu、Lys、Glu、Ser含量比較高, 分別為 8.4%、8.2%、7.9%、7.5%。利用SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)在線軟件, 分析TRαA的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖 1), 結(jié)果顯示該蛋白含有8個(gè)不同長(zhǎng)度的α 螺旋結(jié)構(gòu)、1個(gè)典型的β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲。

圖 1 牙鲆TRαA受體蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 1 Prediction of protein structure of P. olivaceus TRαA receptor

2.3 TRαA基因的RT-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示, 實(shí)驗(yàn)組在長(zhǎng)度1200 bp處顯示有一特異性條帶, 與預(yù)期大小相同,而對(duì)照組均出現(xiàn)一個(gè)相應(yīng)的亮度減弱且二者亮度相同的條帶, 原因可能是HEK293T細(xì)胞中存在牙鲆TRαA基因的同源序列; 實(shí)時(shí)定量PCR也顯示, 與對(duì)照組相比, 實(shí)驗(yàn)組TRαAmRNA表達(dá)水平顯著升高,這都表明轉(zhuǎn)染p3×Flag-TRαA的HEK293T細(xì)胞中, 成功轉(zhuǎn)錄出牙鲆TRαAmRNA(圖 2)。

圖 2 重組質(zhì)?；蚩蛰d轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞TRαA mRNA RTPCR及實(shí)時(shí)定量RT-PCR表達(dá)分析Fig. 2 RT-PCR and real time quantitative RT-PCR analysis of P.olivaceus TRαA mRNA in the HEK293T transfected with recombinant or vacant vector using 18S as an internal reference

2.4 融合蛋白3×Flag-TRαA的Western blot檢測(cè)

BCA法(圖 3)測(cè)得未轉(zhuǎn)染、空載轉(zhuǎn)染和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞提取的總蛋白濃度分別是2.055、1.650和3.440 μg/μL, SDS-PAGE上樣10 μg分離蛋白條帶后, Western blot分析顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組檢測(cè)到一條50 kD大小條帶, 其蛋白分子量與3×Flag-TRαA融合蛋白的大小相符; 而未轉(zhuǎn)染及空載轉(zhuǎn)染組未檢測(cè)到目的條帶(圖 4)。原則上空載轉(zhuǎn)染組可被抗Flag標(biāo)簽單抗特異性識(shí)別, 只因3×Flag蛋白分子與目標(biāo)融合蛋白相比太小僅2.9 kD,分離膠底部被切除或已跑脫導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)到。

2.5 目的蛋白的分離純化

通過(guò)Western blot在洗脫液中可檢測(cè)出50 kD左右的蛋白, 即通過(guò)親和層析、過(guò)濾除菌得到了純化的融合蛋白3×Flag-TrαA(圖 5)。

2.6 候選靶啟動(dòng)子的篩選與重組報(bào)告載體構(gòu)建

根據(jù)atoh8基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果, 分別設(shè)計(jì)了3個(gè)上游引物, 1個(gè)下游引物, 試以牙鲆基因組DNA 為模板擴(kuò)增atoh8基因5′-側(cè)翼序列的各缺失片段, 電泳結(jié)果顯示其大小約為1500、1300和700 bp, 實(shí)際擴(kuò)增出的片段大小為1517、1333和708 bp (圖 6A為其實(shí)際擴(kuò)增測(cè)序的序列, 引物與預(yù)測(cè)TREs位點(diǎn)已標(biāo)出), 與NCBI上傳的大小稍有出入, 并成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708。

圖 3 BCA法測(cè)定蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Determination of protein concentration standard curve by BCA method

圖 4 融合蛋白3×Flag-TRαA的Western blot分析Fig. 4 Western blot analysis of fusion protein 3×Flag-TrαA

圖 5 純化融合蛋白3×Flag-TRαA的Western blot分析Fig. 5 Western blot analysis of purified fusion protein 3×Flag-TRαA

2.7 atoh8基因啟動(dòng)子研究

根據(jù)預(yù)測(cè)TRE位點(diǎn)所在位置, 分別截取了3個(gè)缺失片段, 大小分別為1517、1333和708 bp, 依次包含3個(gè)、2個(gè)、1個(gè)TRE位點(diǎn), 測(cè)序結(jié)果如圖 6A所示,各缺失片段起止區(qū)段如圖 6B所示。分別檢測(cè)每一缺失片段的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性, 對(duì)每一缺失片段進(jìn)行3種處理(不加TRαA和T3、只加TRαA或同時(shí)加TRαA與T3)后再分別檢測(cè)其對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響, 結(jié)果如下: 圖 7A顯示, 與pGL3-Basic轉(zhuǎn)染組(陰性對(duì)照)相比, pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708轉(zhuǎn)染組報(bào)告基因均表達(dá), 表明Pro-atoh8-1517/1333/708都具有啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性, 且Pro-atoh8-1333活性最高, Pro-atoh8-1517活性最低; 圖 7D顯示, 與僅轉(zhuǎn)染pGL3-Pro-atoh8-708相比, 同時(shí)轉(zhuǎn)染pGL3-Proatoh8-708和p3×Flag-TRαA的報(bào)告基因的表達(dá)量無(wú)顯著變化, 再加T3后也無(wú)顯著變化, 說(shuō)明此缺失片段不存在TRαA受體介導(dǎo)T3調(diào)控的TRE位點(diǎn); 圖 7C則表明, 與只轉(zhuǎn)染pGL3-Pro-atoh8-1313相比, 同時(shí)轉(zhuǎn)染pGL3-Pro-atoh8-1313和p3×Flag-TRαA的報(bào)告基因的表達(dá)量顯著降低, 且這種降低在加T3后其又顯著上調(diào), 說(shuō)明在Pro-atoh8-1333中存在1個(gè)TRE位點(diǎn); 圖 7B顯示, 與只轉(zhuǎn)染pGL3-Pro-atoh8-1517相比,同時(shí)轉(zhuǎn)染pGL3-Pro-atoh8-1517和p3×Flag-TRαA的報(bào)告基因的表達(dá)量略有升高, 再加T3后其顯著升高, 表明Pro-atoh8-1517存在2個(gè)TRE位點(diǎn)(包括Proatoh8-1313的1個(gè)TRE位點(diǎn)); 顯然, 無(wú)論是Pro-atoh8-1517還是Pro-atoh8-1333, T3加入后都會(huì)誘導(dǎo)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高, 即啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性顯著增強(qiáng), 因此說(shuō)明, T3通過(guò)結(jié)合在atoh8基因啟動(dòng)子區(qū)(-1497— -688)特異的2個(gè)TRE序列上的TRαA受體來(lái)調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄。

3 討論

為了鑒定出TH-TRαA信號(hào)通路上直接調(diào)控的靶基因, 綜合預(yù)測(cè)出候選靶基因atoh8(Gene ID:109627718), 克隆其5′-側(cè)翼序列各缺失片段并成功構(gòu)建pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708(分別含TRE位點(diǎn): 3、2、1)。本研究克隆了牙鲆TRαA基因完整CDS區(qū), 全長(zhǎng)1251 bp (5′端多加1 bp保證TRαA受體正確翻譯), 且TRαA受體DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)非常保守, 為調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活與抑制所必需。已有研究[7,18]證實(shí), DBD功能域最保守, 內(nèi)有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu), 第一鋅指內(nèi)含有P盒, 為識(shí)別并結(jié)合TREs之AGGTCA(TRs半位)所必需; 第二鋅指內(nèi)含有D盒, 識(shí)別DR4元件(兩半位之間間隔4個(gè)核苷酸)兩半位(half-site)的間隔并參與受體二聚體的形成。RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分析均表明成功構(gòu)建p3×Flag-TRαA重組真核表達(dá)載體, 在目的蛋白N端融合Flag純化標(biāo)簽, 由于3×Flag標(biāo)簽分子量相對(duì)較小, 因此幾乎不會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性,純化產(chǎn)物可直接用于蛋白功能的研究。3×Flag-TRαA的外源性真核表達(dá)特異性強(qiáng), 具有翻譯后加工修飾功能, 使其結(jié)構(gòu)、糖基化方式更接近天然蛋白且生物活性穩(wěn)定[19]。

圖 6 報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708示意圖Fig. 6 Schematic diagram of the reporter gene plasmid pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708

進(jìn)而為了驗(yàn)證TRαA受體與atoh8基因5′-側(cè)翼序列是否存在相互作用, 針對(duì)上述截取的atoh8基因5′-側(cè)翼序列的3個(gè)缺失片段(大小分別為1517、1333和708 bp, 依次包含3個(gè)、2個(gè)、1個(gè)TRE位點(diǎn)),及相應(yīng)成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn), 首先檢測(cè)了atoh8基因3個(gè)不同長(zhǎng)度(1517、1333和708 bp)的5′-側(cè)翼序列對(duì)其啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響, 其次針對(duì)每一缺失片段, 進(jìn)行了3種處理: 不作任何處理(TRαA和T3都不加)、只加TRαA或同時(shí)加TRαA與T3, 分別檢測(cè)其對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。需要指出的是, 截取的atoh8基因5′-側(cè)翼序列長(zhǎng)度為708 bp時(shí), 相關(guān)轉(zhuǎn)染組結(jié)果顯示TRαA受體和T3對(duì)其啟動(dòng)子活性并無(wú)顯著作用, 故不進(jìn)行分析討論, 以下僅討論關(guān)于pGL3-Pro-atoh8-1517/1333轉(zhuǎn)染組的情況。研究表明, 與對(duì)照組相比, 上述2個(gè)缺失片段都具有啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性, 其中截取atoh8基因5′-側(cè)翼序列長(zhǎng)度為1333 bp時(shí)的活性最高, 是長(zhǎng)度為1517 bp時(shí)的大約3倍。據(jù)報(bào)道, 并非是截取基因的5′-側(cè)翼序列越長(zhǎng)其啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性越高[20], 本文結(jié)果亦如此。與僅轉(zhuǎn)染pGL3-Pro-atoh8-1313的實(shí)驗(yàn)組相比,同時(shí)轉(zhuǎn)染pGL3-Pro-atoh8-1313和p3×Flag-TRαA的報(bào)告基因的表達(dá)量顯著降低, 但這種降低可被T3顯著上調(diào), 表明此缺失片段存在TRαA介導(dǎo)T3調(diào)控的TRE位點(diǎn)。對(duì)于pGL3-Pro-atoh8-1517轉(zhuǎn)染組, 雖然pGL3-Pro-atoh8-1517包含pGL3-Pro-atoh8-1333的TRE位點(diǎn), 但在TRαA受體加入后, 與不作任何處理組相比, 其啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性反而略有升高, T3加入后又使得其啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性顯著升高, 這提示在加入與pGL3-Pro-atoh8-1333轉(zhuǎn)染組等量的TRαA受體后, pGL3-Pro-atoh8-1517 5′端第1個(gè)TRE位點(diǎn)與第2個(gè)TRE位點(diǎn)結(jié)合TRαA受體, 綜合效應(yīng)是第1個(gè)TRE位點(diǎn)中和了第2個(gè)TRE位點(diǎn)TRαA受體對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄水平的降低, 說(shuō)明第1個(gè)TRE位點(diǎn)起了一個(gè)正向調(diào)節(jié)作用。也就是說(shuō), pGL3-Pro-atoh8-1517包含的5′端起第1個(gè)TRE位點(diǎn)與第2個(gè)TRE位點(diǎn)通過(guò)TRαA受體介導(dǎo)T3調(diào)控著atoh8基因的表達(dá)水平, 避免表達(dá)過(guò)強(qiáng)或不足, 這可能是機(jī)體實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控atoh8基因表達(dá)的一種方式。但無(wú)論是pGL3-Proatoh8-1517轉(zhuǎn)染組還是pGL3-Pro-atoh8-1333轉(zhuǎn)染組, T3對(duì)atoh8的轉(zhuǎn)錄水平都是一種正向調(diào)節(jié)作用。

圖 7 牙鲆atoh8基因啟動(dòng)子活性測(cè)定Fig. 7 Determination of promoter activity of P. olivaceus atoh8 gene

綜上所述, 本研究結(jié)果表明pGL3-Pro-atoh8-1517包含2個(gè)TRE位點(diǎn), 且TRαA受體通過(guò)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)結(jié)合在atoh8基因5′調(diào)控區(qū)-1497—-688特異的TRE序列來(lái)調(diào)節(jié)該基因的轉(zhuǎn)錄, 由此證明atoh8是TRαA介導(dǎo)TH調(diào)控的直接靶基因。本研究為深入探究甲狀腺激素受體TRαA介導(dǎo)甲狀腺激素調(diào)控的信號(hào)通路提供了基礎(chǔ)依據(jù)。