陳紅菊 張 軒 許高朋 姚智磊 趙 燕 王 慧 季相山

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)試驗(yàn)室, 泰安 271018)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei) 具有含肉率高、生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)、耐低鹽度和高密度養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn), 成為世界對(duì)蝦養(yǎng)殖的三大品種之一[1]。但因其免疫系統(tǒng)以天然免疫為主, 缺乏特異性免疫[2], 自2009年以來(lái), 凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥(Acute Hepatopancreas Necrosis Syndrome,AHPNS)在中國(guó)、泰國(guó)、越南、印度尼西亞、印度和墨西哥等地對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中爆發(fā)并蔓延[3,4], 造成養(yǎng)殖對(duì)蝦大量死亡, 對(duì)全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[5,6]。該病主要的病理特征是肝胰腺壞死, 癥狀表現(xiàn)為昏睡、厭食、生長(zhǎng)緩慢、顏色蒼白、軟殼等[7], 據(jù)研究其主要致病菌為副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)[8,9]。

副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌, 通過(guò)分泌溶血素使多種海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)發(fā)生疾病[10],能引起對(duì)蝦體表潰瘍和出血性敗血等癥狀[11,12], 具有使對(duì)蝦死亡速度快、傳播廣泛等特點(diǎn)。該致病菌也可導(dǎo)致人類(lèi)食物中毒或腸胃炎, 主要由于人食用了未煮熟的海產(chǎn)品或污染的腌漬食物而感染發(fā)病[13]。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的消毒劑主要有鹵素類(lèi)、季銨鹽類(lèi)和醛類(lèi)等, 主要應(yīng)用于清塘消毒、苗種消毒、預(yù)防和控制養(yǎng)殖過(guò)程中的微生物病害等[14]。有研究者分別用三氯異氰脲酸、苯扎溴銨[15]、季銨鹽[16]、聚維酮碘[17]等消毒劑殺滅對(duì)蝦養(yǎng)殖池中的副溶血弧菌, 但效果不甚理想, 因此急需找到能高效殺滅該病原菌的消毒劑。本文選取了22種常見(jiàn)消毒劑進(jìn)行試驗(yàn), 以期篩選出一種殺滅副溶血弧菌的高效低毒消毒劑, 并對(duì)該藥物的安全性進(jìn)行分析, 以及確定該藥物對(duì)人工感染副溶血弧菌并有發(fā)病癥狀的凡納濱對(duì)蝦的治療效果, 為AHPNS的防治提供有效的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與養(yǎng)殖

試驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦: 體長(zhǎng)9.30—11.70 cm, 養(yǎng)殖在40 L的聚氯乙烯塑料桶中, 養(yǎng)殖密度為0.5只/L, 養(yǎng)殖用水經(jīng)二氧化氯消毒、曝氣處理后使用, 水體pH8.0, 鹽度6.3, 水溫(25±2)℃。

1.2 菌懸液的制備

所用菌種為副溶血弧菌(20130629002S01), 由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所黃倢教授惠贈(zèng), 其他為本試驗(yàn)室保存的菌種。取少許菌種滴入5—10 mL TCBS培養(yǎng)基中, 置37℃振蕩培養(yǎng)18—24h后離心棄上清液, 加入無(wú)菌生理鹽水振蕩重懸成菌懸液。細(xì)菌濃度比濁測(cè)定法測(cè)菌懸液濃度, 然后稀釋至所需濃度, 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 懸液定量殺菌試驗(yàn)

采用懸液定量殺菌試驗(yàn)[18]研究不同消毒劑對(duì)副溶血弧菌的殺滅效果。將4 mL消毒液(待測(cè)濃度的1.25倍)與1 mL副溶血弧菌菌懸液(濃度為1×106cfu/mL)混勻后立即計(jì)時(shí)。對(duì)照組加入等量的生理鹽水, 每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。室溫下反應(yīng)1h后, 吸取0.10 mL混合液接種到培養(yǎng)基上, 37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù), 計(jì)算活菌濃度(cfu/mL), 并換算為對(duì)數(shù)值(N), 然后按下式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值: 殺滅對(duì)數(shù)值(KL)=對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值(No)-實(shí)驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值(Nx)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 PHMG的急性毒性試驗(yàn)

采用靜水法藥浴方式測(cè)定PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦的半致死濃度和安全濃度。PHMG濃度按照等對(duì)數(shù)間距法設(shè)置, 共設(shè)置5個(gè)梯度, 對(duì)數(shù)值從0.70—2.70進(jìn)行5等分, 間隔為0.85, 分別是0.70、0.15、1.00、1.85、2.70, 以10為底進(jìn)行指數(shù)取值,則對(duì)應(yīng)的濃度梯度分別為: 0.20、1.44、10.21、72.19和500.00 mg/L, 對(duì)照組為0, 每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。觀察記錄24h和48h死亡數(shù)并計(jì)算死亡率, 采用karber法計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50), 根據(jù)半致死濃度計(jì)算安全濃度(SC):

1.5 PHMG對(duì)攻毒副溶血弧菌凡納濱對(duì)蝦的保護(hù)作用

在凡納濱對(duì)蝦第四步足下注射不同濃度副溶血弧菌: 1×103、1×104、1×105、1×106和1×107cfu/mL, 生理鹽水注射作為對(duì)照組, 注射體積為10 μL。記錄24h和48h的對(duì)蝦死亡率。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果,選取1×107cfu/mL做為感染濃度。養(yǎng)殖用水中加入PHMG對(duì)攻毒對(duì)蝦進(jìn)行保護(hù), PHMG設(shè)置5個(gè)濃度梯度: 0.20、0.50、0.80、1.10和1.40 mg/L, 不加PHMG組做對(duì)照, 每組受試對(duì)蝦20只, 設(shè)置3個(gè)重復(fù)。統(tǒng)計(jì)24h和48h凡納濱對(duì)蝦的成活率與死亡率。并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦的相對(duì)保護(hù)率 (Relative percentage of survival,RPS):

計(jì)算在水體中加入上述5個(gè)濃度梯度PHMG 24h和48h后凡納濱對(duì)蝦肝胰腺的弧菌數(shù)量。每組隨機(jī)解剖10只對(duì)蝦, 并剝離肝胰腺組織于滅菌研磨管中, 研磨成均勻混合液。用1.5%的滅菌生理鹽水按1∶1、1∶10、1∶100和1∶1000四個(gè)稀釋度進(jìn)行稀釋, 每個(gè)濃度取100 μL混合液涂于TCBS培養(yǎng)基上,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù), 28℃倒置培養(yǎng)24—48h, 計(jì)數(shù),取平均值, 計(jì)算出每mL肝胰腺中的弧菌數(shù)量。

1.6 PHMG在水中的降解速率測(cè)定

PHMG的測(cè)定采用光電比色法[19], 首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn): 配制不同濃度的PHMG溶液: 0、0.20、0.50、1.00、2.00和4.00 mg/L, 在535 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值, 以PHMG含量與其對(duì)應(yīng)的吸光值作圖, 得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 建立回歸方程。配制0.50和1.00 mg/L PHMG溶液, 在第0至第7天時(shí), 每天取10 mL水樣測(cè)定PHMG在水體中的濃度。

2 結(jié)果

2.1 不同種類(lèi)消毒劑對(duì)副溶血弧菌的殺滅能力研究

比較了22種消毒劑對(duì)副溶血弧菌的殺滅能力,結(jié)果表明, 在22種消毒劑中, 殺滅效果最好的為聚六亞甲基胍鹽酸鹽(PHMG), 0.50 mg/L的PHMG作用48h, 殺滅對(duì)數(shù)值達(dá)到了6.00±0.89, 能100%殺滅受試的副溶血弧菌。其次為碘溴海因, 殺滅對(duì)數(shù)值為5.60±0.73。季銨鹽類(lèi)消毒劑中的雙鏈季銨鹽絡(luò)合碘的殺滅效果也較好, 殺滅對(duì)數(shù)值達(dá)到5.52±0.58。殺滅能力最差的是醛類(lèi)和醇類(lèi)消毒劑, 殺滅對(duì)數(shù)值僅為1.00(表 1)。

2.2 不同濃度PHMG對(duì)副溶血弧菌的殺滅效果研究

為了進(jìn)一步研究PHMG對(duì)副溶血弧菌的殺滅能力, 本文比較了0.10—0.50 mg/L的PHMG對(duì)副溶血弧菌的殺滅效果。結(jié)果顯示(表 2), 濃度為0.10 mg/L時(shí)對(duì)副溶血弧菌殺滅效果較差, 濃度為0.15 mg/L時(shí)能殺死一定數(shù)量的副溶血弧菌, 當(dāng)濃度達(dá)到0.20 mg/L時(shí)就能100%殺死副溶血弧菌(殺滅對(duì)數(shù)值為6.00±0.58), 與0.50 mg/L組的殺滅效果沒(méi)有差異。

表 1 不同消毒劑對(duì)副溶血弧菌的殺滅能力Tab. 1 The killing ability of different disinfectants to Vibrio parahaemolyticus

2.3 不同濃度PHMG對(duì)7種常見(jiàn)病原菌和1種芽孢桿菌的殺滅能力研究

為檢測(cè)PHMG的廣譜殺菌能力, 本文研究了PHMG作用48h對(duì)7種常見(jiàn)病原菌和1種益生菌(凝結(jié)芽孢桿菌)的殺滅能力。結(jié)果如表 3所示, PHMG對(duì)弧菌的殺滅作用非常強(qiáng), 0.20 mg/L PHMG就能100%地殺滅副溶血弧菌和溶藻弧菌, 對(duì)其他兩種弧菌的殺滅效果也較強(qiáng)(48h的殺滅對(duì)數(shù)值分別是4.37±0.91和5.32±0.25); 0.50 mg/L PHMG能100%地殺滅這四種弧菌, 顯示了PHMG對(duì)弧菌具有較好的殺滅效果。PHMG對(duì)遲鈍愛(ài)德華菌、嗜水氣單胞菌和海豚鏈球菌的殺滅效果較差, 0.20和0.50 mg/L的PHMG都不能完全將其殺死, 1.00和2.00 mg/L的PHMG能100%地殺死遲鈍愛(ài)德華菌和嗜水氣單胞菌, 但仍然無(wú)法完全將海豚鏈球菌殺死。PHMG對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的殺滅效果最差, 這可能與凝結(jié)芽孢桿菌能形成芽孢, 抗逆能力較強(qiáng)有關(guān)?？傮w而言,PHMG不僅能殺滅對(duì)蝦急性肝胰腺壞死癥的主要病原之一: 副溶血弧菌, 也能防止其他致病菌特別是弧菌的感染, 從而預(yù)防其他疾病的發(fā)生。

2.4 PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性

為測(cè)試PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全性程度, 進(jìn)行了PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果顯示, 當(dāng)PHMG的濃度低于1.44 mg/L時(shí), 48h內(nèi)無(wú)死亡現(xiàn)象; 當(dāng)PHMG濃度達(dá)到10.21 mg/L時(shí), 24h死亡率為(16.65±0.06)%, 48h的死亡率為(36.65±0.08)%;濃度為72.19 mg/L時(shí), 24h的死亡率為(28.35±0.08)%,48h的死亡率為(71.65±0.08)%; 當(dāng)濃度為500.00 mg/L時(shí), 24h之內(nèi)對(duì)蝦全部死亡(圖 1)。根據(jù)24h和48h的死亡率數(shù)據(jù), 計(jì)算得出PHMG 24h的LC50=80.28 mg/L; 48h的LC50=23.32 mg/L, 安全濃度SC=0.59 mg/L。

表 2 不同濃度的PHMG對(duì)副溶血弧菌的殺滅效果Tab. 2 Killing effect of different concentrations of PHMG on Vibrio parahaemolyticus

2.5 PHMG對(duì)攻毒副溶血弧菌凡納濱對(duì)蝦的保護(hù)作用

不同濃度的副溶血弧菌攻毒凡納濱對(duì)蝦后, 試驗(yàn)結(jié)果顯示, 副溶血弧菌菌懸液濃度在1×107cfu/mL時(shí), 48h內(nèi)可以使對(duì)蝦死亡數(shù)量達(dá)到(70±1.73)%以上(圖 2), 因此選擇1×107cfu/mL作為治療試驗(yàn)中PHMG的侵染濃度。

在對(duì)蝦第四步足處注射10 μL 1×107cfu/mL的副溶血弧菌菌懸液, 然后向水中分別加入PHMG,使其在水中濃度達(dá)到0.2、0.5、0.8、1.1和1.4 mg/L。試驗(yàn)結(jié)果顯示, PHMG濃度在0.2 mg/L時(shí), 對(duì)被副溶血弧菌感染的病蝦有明顯的保護(hù)效果, 對(duì)蝦相對(duì)保護(hù)率達(dá)到(33.33±13.00)%(24h)和(22.22±9.11)%(48h)左右; 濃度達(dá)到0.5 mg/L時(shí), 24h及48h對(duì)對(duì)蝦的相對(duì)保護(hù)率達(dá)(77.78±5.01)%、(77.78±5.89)%, 且與0.8 mg/L組24h(83.33±2.90)%及48h(77.78±9.17)%、1.1 mg/L組24h(83.33±8.99)%及48h(83.33±9.07)%、1.4 mg/L組24h(88.89±6.07)% 及48h(88.89±5.14)%組相對(duì)保護(hù)率沒(méi)有顯著差異(圖 3)。

表 3 不同濃度PHMG對(duì)不同病原菌和一種益生菌的殺滅能力Tab. 3 The killing ability of different concentrations of PHMG against different pathogenic bacteria and one kind of probiotics

圖 1 不同濃度的PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致死率Fig. 1 The lethal rate of different concentrations of PHMG against Litopenaeus vannamei

圖 2 不同濃度的副溶血弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致死率Fig. 2 The lethal rate of different concentrations of Vibrio parahaemolyticus against Litopenaeus vannamei

為了解PHMG對(duì)攻毒副溶血弧菌凡納濱對(duì)蝦的保護(hù)作用, 除計(jì)算上述相對(duì)保護(hù)率外, 還計(jì)算了水體中加入不同濃度梯度PHMG 24h和48h后凡納濱對(duì)蝦肝胰腺的副溶血弧菌數(shù)量。結(jié)果顯示(圖 4),隨著PHMG濃度的升高, 凡納濱對(duì)蝦肝胰腺所含副溶血弧菌數(shù)量明顯減少, 48h后1.1 mg/L組及1.4 mg/L組肝胰腺內(nèi)菌數(shù)量降為0。

圖 3 不同濃度的PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦的保護(hù)作用Fig. 3 The protective effect of different concentrations of PHMG on Litopenaeus vannamei infected by Vibrio parahaemolyticus

2.6 不同濃度PHMG在水體中的降解試驗(yàn)

第0至第7天, 每天測(cè)定PHMG在水體中的剩余濃度, 結(jié)果顯示: 0.50 mg/L的PHMG組, 前4d都沒(méi)有顯著變化, 在第5和第6天濃度顯著下降。1.00 mg/L的PHMG組, 在試驗(yàn)的7d中比較穩(wěn)定, 濃度在(0.73±0.05)—(1.02±0.04) mg/L, 在后期雖略有下降, 但差異不顯著(圖 5), 這說(shuō)明PHMG能在水體中長(zhǎng)時(shí)間地存在, 具有性能穩(wěn)定、低降解的優(yōu)點(diǎn)。

3 討論

3.1 不同消毒劑對(duì)弧菌的殺滅效果

弧菌是一類(lèi)革蘭氏陰性、具極生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢的短桿狀細(xì)菌, 由弧菌引起的弧菌病在全球范圍內(nèi)廣泛發(fā)生, 其爆發(fā)性流行給海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)及甲殼類(lèi)等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[20], 副溶血弧菌導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死癥就是其中一個(gè)典型的例子。本試驗(yàn)結(jié)果顯示, 不同種類(lèi)的消毒劑對(duì)副溶血弧菌這一特定目標(biāo)細(xì)菌的殺滅效果差異較大, 殺滅效果較低的主要有醛類(lèi)、過(guò)氧化物類(lèi)等。這與前人的各種消毒劑對(duì)弧菌殺滅效果的研究結(jié)果基本一致, 如研究發(fā)現(xiàn)戊二醛對(duì)創(chuàng)傷弧菌的最小抑菌濃度(MIC)為310 mg/L、最小殺菌濃度(MBC)為10000 mg/L[21];過(guò)氧乙酸對(duì)創(chuàng)傷弧菌的MIC為40 mg/L、MBC為310 mg/L, 對(duì)溶藻弧菌和副溶血弧菌的MIC均為32 mg/L, 對(duì)溶藻弧菌的MBC為64 mg/L, 對(duì)副溶血弧菌的MBC為128 mg/L[22]; 用200 mg/L過(guò)氧乙酸作用5min才能完全殺滅海水中的副溶血弧菌[23]。溴氯海因類(lèi)對(duì)溶藻弧菌的MIC、MBC均為2.32 mg/L[24]。這些結(jié)果都說(shuō)明多數(shù)消毒劑對(duì)弧菌的殺滅效果較差。

圖 4 不同濃度的PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)副溶血弧菌數(shù)量的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of PHMG on Vibrio Parahaemolyticus in Litopenaeus vannamei

圖 5 0.50與1.00 mg/L的PHMG 7d內(nèi)在水體中的剩余濃度Fig. 5 Residual concentration of 0.50 and 1.00 mg/L PHMG in water after 7 days

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)22種消毒劑中PHMG殺滅副溶血弧菌的效果最好, 其次是雙鏈季銨鹽絡(luò)合碘, 殺滅對(duì)數(shù)值達(dá)到5.52±0.58。張瑋等[25]用體外抑菌試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)PHMG對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌、漂浮弧菌、哈維弧菌、鰻弧菌及沙蠶弧菌的殺滅能力較強(qiáng),MIC和MBC分別為1.5和3.0 mg/L。PHMG溶于水后胍基帶正電荷, 可以強(qiáng)烈且迅速地被細(xì)菌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的含磷酸復(fù)合物吸附, 并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部, 與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生作用, 使細(xì)胞分裂阻滯并產(chǎn)生染色體凝集反應(yīng), 從而殺滅細(xì)菌[26—29]。而季銨鹽類(lèi)屬于陽(yáng)離子表面活性劑類(lèi)消毒劑, 其殺菌機(jī)理也是水解產(chǎn)物帶有正電荷, 易于吸附在帶有負(fù)電荷的細(xì)菌表面, 堵塞細(xì)菌的呼吸通道, 或者使細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生破裂, 細(xì)胞內(nèi)容物流出[30]。雙鏈季銨鹽絡(luò)合碘不僅能較好的與細(xì)胞膜結(jié)合, 且含有高效殺滅細(xì)菌的絡(luò)合碘, 能進(jìn)一步增強(qiáng)其殺菌能力。這可能是PHMG和雙鏈季銨鹽絡(luò)合碘殺滅副溶血弧菌能力比較強(qiáng)的原因。

3.2 PHMG對(duì)不同菌種殺滅能力差異

本研究中我們發(fā)現(xiàn), 相同濃度PHMG對(duì)G-菌和G+菌的殺滅能力存在差異, 在1.00 mg/L時(shí)對(duì)四種弧菌和遲鈍愛(ài)德華菌、嗜水氣單胞菌等六種G-菌的殺滅率達(dá)到100%, 而對(duì)兩種G+菌海豚鏈球菌和凝結(jié)芽孢桿菌的殺滅效果較差, 殺滅對(duì)數(shù)值僅為:3.80±0.92和2.20±0.14。這種差異的存在可能與PHMG殺菌機(jī)理及細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。首先,根據(jù)殺菌機(jī)理, PHMG溶于水后胍基帶正電荷, 可以強(qiáng)烈且迅速地被細(xì)菌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的含磷酸復(fù)合物吸附, 并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部, 與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生作用, 使細(xì)胞分裂阻滯并產(chǎn)生染色體凝集反應(yīng), 從而殺滅細(xì)菌[26—29]。因此, PHMG對(duì)表面帶負(fù)電荷的G-菌的殺滅能力優(yōu)于對(duì)G+菌殺滅能力。其次, G+菌和G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有差異, 細(xì)菌細(xì)胞壁是細(xì)胞質(zhì)膜外具有一定硬度和韌性的壁套, 主要由肽聚糖構(gòu)成, 細(xì)胞壁的保護(hù)作用體現(xiàn)為細(xì)胞壁固定細(xì)胞外形和提高機(jī)械強(qiáng)度, 從而使其免受滲透壓等外力的損傷。在化學(xué)組成上G+菌的細(xì)胞壁90%為肽聚糖, 可多達(dá)50層, G-菌則只含有1—2層[31],因此估計(jì)這也是G+菌抗PHMG攻擊能力更強(qiáng)些的原因之一。

在濃度較低時(shí), PHMG對(duì)同是G-菌的六種細(xì)菌殺滅能力也存在差異, 0.50 mg/L PHMG對(duì)四種弧菌的殺滅率達(dá)到100%, 而對(duì)其他兩種G-菌遲鈍愛(ài)德華菌和嗜水氣單胞菌殺滅能力較弱, 殺滅對(duì)數(shù)值僅為: 3.10±0.17和3.36±0.67。這是由于遲鈍愛(ài)德華菌和嗜水氣單胞菌皆可在浮游動(dòng)物、甲殼動(dòng)物及水草上形成生物被膜[32]。生物被膜是一種高度有組織的不均質(zhì)性結(jié)構(gòu), 由同一種菌或不同種菌形成的三維結(jié)構(gòu), 基質(zhì)包繞微菌落呈“蘑菇狀”, 是細(xì)菌抵抗外界不良環(huán)境的一種自我保護(hù)形式, 對(duì)周?chē)h(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。在生物被膜狀態(tài)下的微生物對(duì)消毒劑和抗生素都有很強(qiáng)的抗性, 消毒劑很難將其徹底殺滅[33]。

在任何濃度時(shí), PHMG對(duì)益生菌凝結(jié)芽孢桿菌殺滅能力最差, 這可能是由于芽孢桿菌具有形成芽孢的特殊能力, 能夠抵抗某些極端惡劣情況。這種現(xiàn)象表明該消毒劑對(duì)益生菌中的芽孢類(lèi)是友好型的, 在對(duì)副溶血弧菌最小殺菌濃度下, 可以最可能的減少對(duì)益生菌的損傷。

3.3 PHMG的急性毒性和防治AHPNS研究

生產(chǎn)實(shí)踐中, 消毒劑的安全性也是需要考慮的重要因素之一, 不同消毒劑對(duì)對(duì)蝦的毒性大小不同。本研究發(fā)現(xiàn)PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦24h的LC50=80.28 mg/L、48h的LC50=23.32 mg/L, 安全濃度SC=0.59 mg/L, 這與前人的研究結(jié)果基本一致[25]。張萍等[34]研究顯示, PVP-碘對(duì)南美白對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體的24h和40h半致死濃度分別為8.737和6.512 mg/L,其安全濃度為0.65 mg/L。復(fù)方三氯異氰尿酸對(duì)短溝對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦的安全濃度分別為0. 55和0. 53 mg/L[35]。過(guò)氧化氫對(duì)日本對(duì)蝦的安全濃度為3.27 mg/L[36]。劉春花等[37]證明新型寶碘對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全濃度(SC)為8.2 mL/L。由此可見(jiàn), PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全濃度與兩種鹵素類(lèi)消毒劑對(duì)對(duì)蝦的安全濃度值大小相似, 比過(guò)氧化氫安全濃度要小一些。此外, 張瑋等[25]研究了PHMG對(duì)大菱鲆和刺參的48hLC50分別為: 179.91和6.67 mg/L, 而鮑在處理后48h未死亡。這說(shuō)明了PHMG是一種低毒的消毒劑, 在殺滅目標(biāo)病原菌的濃度范圍內(nèi), 對(duì)水產(chǎn)生物的生存沒(méi)有顯著影響。

由于0.2 mg/L以上的PHMG就能較好地殺死副溶血弧菌, 且PHMG對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全濃度為0.59 mg/L, 大于其有效殺滅副溶血弧菌的濃度, 因此可以用PHMG用來(lái)防治由副溶血弧菌等導(dǎo)致的凡納濱對(duì)蝦AHPNS。本文的研究結(jié)果顯示, 在注射副溶血弧菌菌懸液的同時(shí), 在水體中添加不同濃度的PHMG, PHMG濃度在0.20 mg/L時(shí), 對(duì)被副溶血弧菌感染的病蝦有明顯的治療效果, 對(duì)蝦相對(duì)保護(hù)率達(dá)到(33.33±13.00)%(24h)和(22.22±9.11)%(48h)左右; 濃度達(dá)到0.5 mg/L時(shí), 24h和48h對(duì)對(duì)蝦的相對(duì)保護(hù)率達(dá)(77.78±5.01)%和(77.78±5.89)%, 與0.8 mg/L組24h(83.33±2.90)% 和48h(77.78±9.17)、1.1 mg/L組24h(83.33±8.99)%和48h(83.33±9.07)、1.4 mg/L組24h(88.89±6.07)%和48h(88.89±5.14)組相對(duì)保護(hù)率沒(méi)有顯著差異。這進(jìn)一步證明PHMG可以用來(lái)防治凡納濱對(duì)蝦AHPNS。2009年以來(lái),AHPNS使得亞洲對(duì)蝦產(chǎn)量大幅下降, 給亞洲養(yǎng)蝦業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 我國(guó)以凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖為主的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)亦受到?jīng)_擊。AHPNS是由細(xì)菌感染引起的, 副溶血弧菌是一種重要的致病菌[38]。目前對(duì)于AHPNS的致病機(jī)制尚未研究清楚, 尚無(wú)有效的防治手段[39]。因此, 本研究找到了一種有效防治AHPNS的技術(shù)手段, 具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

3.4 PHMG在水體中的降解情況

水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的消毒劑不但要求高效、低毒, 而且要求性能穩(wěn)定、有效成分不易降解, 才能更加高效地殺滅有害菌。消毒劑中的氯制劑在水體中降解速度較快, 李麗等[40]測(cè)定發(fā)現(xiàn), 在水體中次氯酸鈉的有效氯含量前6h從起始0.35% 急劇降至0.13%; 6—24h的降解速率明顯減緩; 24h后, 有效氯含量基本保持在0.04% 左右。二氧化氯在水體中降解速度較快, 并且二氧化氯的降解速度與光照強(qiáng)度、紫外強(qiáng)度有密切關(guān)系, 在日光照射下, 120min后水體中的二氧化氯就衰減了83.1%, 而在365 nm紫外光的照射下, 僅經(jīng)過(guò)40min水體中的二氧化氯就已經(jīng)基本完全降解[41]。張靜等[42]研究了戊二醛的降解特性, 結(jié)果表明: pH對(duì)戊二醛降解的影響較大, pH保持7—8, 20h后戊二醛降解率達(dá)90%以上。25℃和30℃時(shí), 20h后戊二醛最終降解率分別為83.42%和83.99%, 并且氮存在時(shí)戊二醛的降解率比無(wú)氮時(shí)高出50%以上, 因此在養(yǎng)殖環(huán)境(一般情況氮含量很高)中戊二醛的降解率很高。周書(shū)春[43]、熊永忠等[44]研究指出, 溴氯海因在水環(huán)境中易發(fā)生水解: 在釋放出活性Br-和Cl-后, 自身形成5,5 -二甲基海因, 且很快在自然條件下被光、微生物等降解,分解為氨和二氧化碳。在25℃自然條件下, 溴氯海因溶于水5d后的降解率即達(dá)到88.97%, 7d后低于初始濃度的1%[45]。但也有的消毒劑降解速度較慢,李亞紅等[46]研究了季銨鹽的生物降解、光降解和水解特性, 結(jié)果證明, 在自然條件下季銨鹽在海水中的降解速率較慢, 降解活動(dòng)主要由光降解貢獻(xiàn),強(qiáng)化某些反應(yīng)條件(如紫外光輻照)可以加速季銨鹽的降解速率; 其次為生物降解, 但生物降解性較低,半衰期較長(zhǎng); 雖然有水解發(fā)生, 但水解速率極慢, 半衰期長(zhǎng)達(dá)上百天。本文研究顯示, 0.5 mg/L的PHMG組, 前4d都沒(méi)有顯著變化, 在第5和第6天濃度略有下降, 1 mg/L的PHMG組, 降解速度與0.5 mg/L的PHMG組沒(méi)有顯著差異, 由此可見(jiàn)PHMG具有低降解性、高穩(wěn)定性的特點(diǎn), 適合在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為消毒劑使用。而且, 通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌可以利用PHMG作為生長(zhǎng)氮源, 因此可以認(rèn)為該消毒劑是一種可以生物降解的環(huán)境友好型消毒劑。在自然界中, 通過(guò)細(xì)菌的作用, 可以防止該消毒劑的長(zhǎng)期積累而造成環(huán)境污染[47]。