李思思 周成翀 王 歡 許荔立 張?jiān)娪?謝夢(mèng)琪 陳孝煊 吳志新

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 湖北省水生動(dòng)物病害防控工程技術(shù)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 武漢 430070)

樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)是已知功能最為強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells,APCs), 也是唯一能激活初始T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的細(xì)胞[1]。樹突狀細(xì)胞是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁, 并在控制免疫反應(yīng)的發(fā)生和免疫耐受中發(fā)揮重要的作用。樹突狀細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)來(lái)區(qū)分不同的抗原物質(zhì)并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的類型[2]。研究表明DCs可通過(guò)上調(diào)共刺激分子CD83、CD80和促炎性因子IL-12的表達(dá), 誘導(dǎo)Th1免疫細(xì)胞的產(chǎn)生[3]。DCs也可通過(guò)上調(diào)抗炎性因子IL-4和IL-10的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)Th2免疫細(xì)胞的分化[4]。相比于哺乳動(dòng)物,對(duì)魚類DCs的研究起步較晚。Lugo-Villarino等[5]在斑馬魚(Danio rerio)中發(fā)現(xiàn)了一類具有吞噬活性的樹突樣細(xì)胞, 并對(duì)其刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力進(jìn)行了分析。Bassity等[6]在虹鱒頭腎和脾臟中分離得到一類具有樹突樣形態(tài), 高表達(dá)CD83和MHC-II、可啟動(dòng)混合淋巴反應(yīng)(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)的細(xì)胞。Zoccola等[7]利用SCRIPT為標(biāo)記, 研究了在尖吻鱸(Lates calcarifer)中DCs的分布并進(jìn)行了生物學(xué)功能的分析鑒定。綜合前人的研究, 目前對(duì)魚類DCs的鑒定工作主要圍繞形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)功能開展。在魚類DCs相關(guān)研究中, 通常使用混合淋巴反應(yīng)評(píng)價(jià)魚類DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力, 將同種異體淋巴細(xì)胞與DCs共孵育, 通過(guò)檢測(cè)增殖的淋巴細(xì)胞的數(shù)量反映DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力。但目前尚未有淡水溫水性魚類中DCs存在的報(bào)道。

益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物, 可定植于宿主腸道等組織中[8]。在哺乳動(dòng)物中, 多項(xiàng)研究表明益生菌可調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的功能, 從而影響宿主的免疫水平[9—11]。Hart等[12]發(fā)現(xiàn)乳酸菌可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分泌IL-10, 抑制IL-12的表達(dá), 緩解IBD患者的炎癥反應(yīng)。糞球菌等可抑制CD40等細(xì)胞因子的表達(dá), 減少成熟的樹突狀細(xì)胞的數(shù)量, 避免過(guò)度免疫反應(yīng)的發(fā)生[13]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 益生菌已被證實(shí)可有效促進(jìn)魚體的生長(zhǎng), 改善腸道微環(huán)

境[14, 15]。

枯草芽孢桿菌Ch9(Bacillus subtilisCh9)是一株分離自草魚腸道的益生菌, 在本實(shí)驗(yàn)室之前的研究中證實(shí)使用該菌株可有效減輕嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的腸道損傷[16,17]。本研究通過(guò)魚類細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離獲得草魚樹突狀細(xì)胞, 并比較了其與哺乳動(dòng)物樹突狀細(xì)胞在形態(tài)和功能上的區(qū)別。這些結(jié)果有助于我們更好地理解低等脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng), 并為水產(chǎn)動(dòng)物疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)。此外, 通過(guò)分析益生芽孢桿菌對(duì)樹突狀細(xì)胞免疫功能的調(diào)控, 為其在草魚生態(tài)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用草魚(Ctenopharyngodon idellus, 體重1000—2000 g/尾)來(lái)自湖北省武漢市江夏區(qū)漁場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)前2周暫養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心循環(huán)水系統(tǒng)中。水溫控制在24—28℃, 期間按體重的4%投喂商業(yè)飼料(湖北海大集團(tuán))。每日更換1/3的水并清潔殘余的飼料殘?jiān)?。?shí)驗(yàn)前檢查魚體表無(wú)明顯傷痕和病原感染癥狀。

1.2 實(shí)驗(yàn)用菌株

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)Ah1菌株:分離自細(xì)菌性敗血癥銀鯽腸道, 可引起草魚、銀鯽、團(tuán)頭魴、鰱等魚類細(xì)菌性敗血癥和腸炎。將Ah1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基, 28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后3500 r/min離心10min, 無(wú)菌PBS洗滌兩次后重懸至適宜的濃度備用。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Ch9菌株: 分離自健康草魚腸道。將Ch9菌株接種于LB液體培養(yǎng)基, 28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后離心收集, 無(wú)菌PBS洗滌兩次后重懸至適宜的濃度備用。

UV滅活的枯草芽孢桿菌: 按上述步驟獲得Ch9菌液, PBS洗滌重懸后紫外照射30min。通過(guò)涂布LB平板檢測(cè)照射后菌液中細(xì)菌活性。

上述菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.3 主要試劑的配制

AIM液: 含有47.5 mL L-15培養(yǎng)基, 2.5 mL雙抗,2.5 μg/mL兩性霉素B和25 μg/mL慶大霉素, 置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞原代培養(yǎng)基: 含有44.5 mL L-15培養(yǎng)基,0.5 mL雙抗, 5 mL胎牛血清FBS, 2.5 μg/mL兩性霉素B和25 μg/mL慶大霉素, 置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

L-15培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司, 雙抗、LPS、兩性霉素B和慶大霉素購(gòu)自Biosharp公司, 胎牛血清FBS購(gòu)自ScienCell公司, Ficoll分離液購(gòu)自GE Healthcare公司。

1.4 草魚樹突狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)

選取健康的草魚, 使用過(guò)量MS-222浸泡麻醉致死。在無(wú)菌條件下取出脾臟。AIM液中浸泡, 用無(wú)菌注射器橡膠塞輕輕按壓通過(guò)200目(70 μm)細(xì)胞篩。獲得的單細(xì)胞懸液按照2∶1的體積比輕輕鋪加在盛有Ficoll分離液的15 mL離心管中。800×g室溫離心20min后, 吸取界面層之間的細(xì)胞, 無(wú)菌PBS洗滌兩次, 加入細(xì)胞原代基培養(yǎng)重懸并調(diào)整密度為5×106cells/mL。轉(zhuǎn)移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中, 于28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中, 隔天吸出原培養(yǎng)瓶里一半的培養(yǎng)基, 離心收集懸浮細(xì)胞, 再加入一半新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)7—10d, 收集非貼壁細(xì)胞備用。

1.5 草魚樹突狀細(xì)胞的富集

使用密度為1.067和1.077 g/mL的Percoll密度分離液, 按照說(shuō)明書的步驟操作富集上一步收集到的非貼壁細(xì)胞。富集后的細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗滌兩次,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度。

1.6 姬姆薩染色觀察

將細(xì)胞懸液滴加于玻片上均勻鋪開, 自然風(fēng)干后滴加1—2滴甲醛溶液固定。待自然風(fēng)干后滴加姬姆薩染色工作, 染色15min, PBS輕輕沖洗, 自然晾干后封片觀察。

1.7 樹突狀細(xì)胞生物學(xué)功能鑒定

刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力的測(cè)定: 采用混合淋巴反應(yīng)法來(lái)檢測(cè)草魚樹突狀細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力。同種異體淋巴細(xì)胞的收集根據(jù)Bassity等[6]的方法進(jìn)行。選取體重1000 g左右的健康草魚, 在無(wú)菌條件下取出脾臟, 置于盛有AIM液的培養(yǎng)皿中浸泡1h, 期間用無(wú)菌眼科剪將組織切成1 cm3大小的小塊, 輕輕按壓通過(guò)200目(70 μm)的細(xì)胞篩,獲得的單細(xì)胞懸液按照2∶1的體積比輕輕鋪加在盛有Ficoll分離液的15 mL離心管中。800×g室溫離心20min后, 吸取界面層之間的細(xì)胞, 無(wú)菌PBS洗滌兩次, 加入細(xì)胞原代基培養(yǎng)重懸并調(diào)整密度為5×106cells/mL。轉(zhuǎn)移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中, 于28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置2h, 輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶, 吸取懸浮細(xì)胞即得到淋巴細(xì)胞。使用CFSE染色液, 按照說(shuō)明書進(jìn)行染色。DC和淋巴細(xì)胞均調(diào)整濃度為1×106cells/mL,按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶8的比例分別加入24孔板中?？瞻讓?duì)照組中僅加入等量的淋巴細(xì)胞。28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3d, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)增殖情況。

遷移能力的測(cè)定: 使用Transell板測(cè)定草魚樹突狀細(xì)胞的遷移能力。Transewell小室膜直徑為3 μm, 小于細(xì)胞直徑(＞10 μm)從而降低被動(dòng)遷移的影響。上室加入1×106個(gè)細(xì)胞, 下室分別加入PBS(空白對(duì)照)、LPS (5 μg/mL)、嗜水氣單胞菌Ah1(MOI分別為0.1和1)、枯草芽孢桿菌Ch9 Muhiplieity of infection (MOI分別為0.1和1)。28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h, 輕輕刮去上室的細(xì)胞, 用0.25%的胰蛋白酶消化膜上的細(xì)胞, DAPI染色后, 熒光顯微鏡計(jì)數(shù)。

1.8 膜表面標(biāo)記分子的測(cè)定

調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL接種于24孔板中, 加入LPS至濃度為5 μg/mL。28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12h, 收集細(xì)胞用于檢測(cè)DCs膜表面標(biāo)記分子CD83、CD80/86表達(dá)情況。

1.9 益生芽孢桿菌和樹突狀細(xì)胞共孵育

調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL接種于24孔板中, 按照MOI=100加入U(xiǎn)V滅活的枯草芽孢桿菌,28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。分別于0、2h、4h、8h、12h和24h收集細(xì)胞, 檢測(cè)抗炎性因子IL-4、IL-10的表達(dá)。

1.10 RNA的提取和cDNA的合成

使用Trizol法提取收集到的細(xì)胞樣本的總RNA,并用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和質(zhì)量, -80℃冰箱保存?zhèn)溆谩DNA的合成使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒, 按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得。

1.11 RT-PCR分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量方法(RT-PCR)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)情況, 以β-actin基因作為內(nèi)參基因, 引物序列見表 1。使用LightCycler 480 II熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為: Master Mix 10 μL, ddH2O 7 μL, 上游引物1 μL, 下游引物1 μL,cDNA 1 μL; 每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量, 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SEM)表示。

1.12 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 18軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理, 不同處理組之間的比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent samples,t-test), 多組數(shù)據(jù)間的比較使用Ducan法進(jìn)行分析,P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 草魚樹突狀細(xì)胞分離培養(yǎng)和觀察

從草魚脾臟初始分離的細(xì)胞種類比較復(fù)雜, 由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等組成(圖 1A)。在培養(yǎng)過(guò)夜后, 部分細(xì)胞轉(zhuǎn)為半貼壁狀態(tài)。在培養(yǎng)的第3天, 可見大的、非黏附的圓形細(xì)胞聚集形成集落(圖 1B)。在培養(yǎng)7d后, 小而圓的、非黏附細(xì)胞基本消失; 體積較大的、非黏附細(xì)胞比例上升, 呈現(xiàn)出類似于哺乳動(dòng)物樹突狀細(xì)胞的分枝狀形態(tài)(圖 1C)。

收集這類非貼壁細(xì)胞并使用密度分離法純化后, 流式細(xì)胞分析的結(jié)果顯示細(xì)胞純度有較大提升,通?？蛇_(dá)80%以上。吉姆薩染色結(jié)果顯示(圖 2), 這類細(xì)胞具有典型的樹突樣形態(tài), 不規(guī)則的分葉的細(xì)胞核, 與哺乳動(dòng)物樹突狀細(xì)胞的吉姆薩染色結(jié)果相比具有高度相似性[18,19]。

2.2 草魚樹突狀細(xì)胞生物學(xué)功能分析

圖 3A顯示了孵育3d后流式細(xì)胞儀檢測(cè)混合淋巴反應(yīng)中T細(xì)胞增殖的情況。當(dāng)DC∶淋巴細(xì)胞比例為1∶1時(shí), 增殖細(xì)胞占比為30.76%; 比例為1∶2時(shí), 增殖細(xì)胞占比為20.53%; 比例為1∶4時(shí), 增殖細(xì)胞占比為16.28%; 比例為1∶8時(shí), 增殖細(xì)胞占比為7.42%。結(jié)果表明草魚樹突狀細(xì)胞可有效啟動(dòng)混合淋巴反應(yīng), 刺激T淋巴細(xì)胞增殖且具有劑量依賴性。

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖 3B), 與對(duì)照組相比, 樹突狀細(xì)胞在LPS和嗜水氣單胞菌的刺激下遷移細(xì)胞數(shù)量具有顯著性差異(P＜0.05)。但在枯草芽孢桿菌刺激下的遷移細(xì)胞數(shù)量差異不顯著。這表明草魚樹突狀細(xì)胞可以有效地向抗原物質(zhì)遷移, 以便下一步的捕獲過(guò)程的進(jìn)行。

2.3 草魚樹突狀細(xì)胞膜表面標(biāo)記分子表達(dá)的研究

在LPS刺激12h后, 草魚DCs膜表面標(biāo)記分子CD83、CD80/86表達(dá)顯著提升(圖 4), 與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。

表 1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

2.4 益生枯草芽孢桿菌對(duì)草魚樹突狀細(xì)胞免疫功能的調(diào)控

RT-PCR的結(jié)果表明, 益生枯草芽孢桿菌刺激可以有效促進(jìn)草魚樹突狀細(xì)胞中抗炎性因子IL-4和IL-10的表達(dá)(圖 5)。在2—12h期間, 與對(duì)照組相比均顯著性提升。在24h時(shí)IL-4的表達(dá)差異不顯著,IL-10的表達(dá)仍顯著性提升。

圖 1 不同培養(yǎng)時(shí)期草魚樹突狀細(xì)胞形態(tài)觀察Fig. 1 Morphological observation of dendritic cells of grass carp at different time points

圖 2 草魚樹突狀細(xì)胞的姬姆薩染色圖片F(xiàn)ig. 2 Giemsa staining of dendritic cells of grass carp (Bar=20 μm)

3 討論

在哺乳動(dòng)物中, 常常從骨髓中獲得培養(yǎng)DCs所需的前體細(xì)胞[19]。由于魚類缺乏這類組織, 因此我們對(duì)哺乳動(dòng)物DCs的培養(yǎng)方法進(jìn)行了修改。建立了從魚體內(nèi)重要的免疫器官——脾臟中分離培養(yǎng)DCs的方法。與哺乳動(dòng)物DCs相比, 培養(yǎng)7d后收集得到的樹突狀細(xì)胞, 在形態(tài)、生物學(xué)功能和膜表面分子標(biāo)記的表達(dá)上具有高度的相似性。此外, 與虹鱒[6]和斑馬魚[5]DCs相比, 草魚DCs在應(yīng)對(duì)LPS等抗原刺激時(shí), 與成熟過(guò)程相關(guān)的膜表面分子CD83、CD80/86的表達(dá)更加快速而強(qiáng)烈。這可能是不同物種間的差異所導(dǎo)致。這一結(jié)果也為比較不同環(huán)境下相近物種免疫功能的差別提供了有益的依據(jù)。

在哺乳動(dòng)物DCs培養(yǎng)中, 常常需要添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子如GM-CSF來(lái)促進(jìn)前體細(xì)胞向DCs的分化。在我們前期的實(shí)驗(yàn)中, 向培養(yǎng)的DCs前體細(xì)胞中加入了重組人GM-CSF, 但與對(duì)照組相比, 在DCs產(chǎn)生的數(shù)量上并沒有顯著差異。這一結(jié)果與小鼠脾臟中分離細(xì)胞并在不添加生長(zhǎng)因子情況下獲得未成熟DCs的結(jié)果相似[20]。對(duì)此我們推測(cè)草魚DCs是通過(guò)細(xì)胞自身分泌的生長(zhǎng)因子來(lái)誘導(dǎo)分化成熟。

圖 3 草魚樹突狀細(xì)胞功能分析結(jié)果Fig. 3 Function analysis of dendritic cells of grass carp

圖 4 草魚樹突狀細(xì)胞膜表面分子表達(dá)情況Fig. 4 Relative expression of surface molecular markers on grass carp dendritic cell

圖 5 益生枯草芽孢桿菌刺激后草魚樹突狀細(xì)胞抗炎性因子表達(dá)的變化Fig. 5 Expression of anti-inflammatory cytokines in gDCs stimulated by B. subtilis

CD83和CD80/86是哺乳動(dòng)物成熟DCs的特異性膜表面分子標(biāo)記物。在哺乳動(dòng)物中CD80和CD86是兩種不同的分子標(biāo)記物, 但在魚類中, 普遍認(rèn)為CD80/86基因與哺乳動(dòng)物中CD80和CD86基因具有高度的功能保守。在魚類相關(guān)研究中, 有報(bào)道稱虹鱒的CD83表達(dá)與MHC-II的表達(dá)也具有相關(guān)性[21], 說(shuō)明魚類中CD83的表達(dá)可能也存在和哺乳動(dòng)物類似的調(diào)節(jié)機(jī)制。目前多種魚類中均發(fā)現(xiàn)CD83基因的存在, 在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞中均檢測(cè)到其表達(dá)[22—24]。在哺乳動(dòng)物中, CD83在mRNA水平的表達(dá)不僅僅存在于DCs, 在T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均有檢測(cè)到[25—27], 但蛋白表達(dá)僅存在于DCs中[28,29]。值得注意的是, mRNA水平的表達(dá)并不一定反映產(chǎn)生的蛋白量, 魚類也可能與哺乳動(dòng)物一樣, 對(duì)轉(zhuǎn)錄后的翻譯過(guò)程進(jìn)行調(diào)控, 因此盡管在非DCs的細(xì)胞中也檢測(cè)到CD83的表達(dá), 但CD83依然可以在蛋白水平上作為魚類DCs的特異性標(biāo)記物。下一步的研究可以通過(guò)草魚CD83單克隆抗體進(jìn)行DCs的檢測(cè), 對(duì)魚類DCs的生物學(xué)特征進(jìn)行更深入的分析。

細(xì)胞因子是免疫系統(tǒng)的組成部分, 在免疫功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[30,31]。IL-4、IL-10是IL家族的重要成員, 被認(rèn)為是一類免疫抑制細(xì)胞因子, 在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[32]。IL-4具有誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的能力, 可促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化抑制Th1細(xì)胞的生成, 發(fā)揮抗炎作用[33]。研究表明IL-10可有效抑制Th1細(xì)胞的分化以及IL-1、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子的釋放, 促進(jìn)B、T細(xì)胞的增殖, 增強(qiáng)機(jī)體體液免疫的水平, 此外還可抑制氧自由基(ROS)的產(chǎn)生, 避免過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷[33—35]。在本研究中, 益生枯草芽孢桿菌可有效促進(jìn)草魚樹突狀細(xì)胞IL-4、IL-10的表達(dá), 證實(shí)其可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述, 本研究首次從草魚體內(nèi)分離培養(yǎng)了一類具有典型樹突狀形態(tài)的細(xì)胞, 通過(guò)形態(tài)學(xué)比較、生物學(xué)功能分析和膜表面標(biāo)記分子表達(dá)的研究, 證實(shí)這類細(xì)胞和哺乳動(dòng)物樹突狀細(xì)胞具有高度同源性。這一結(jié)果有助于豐富低等脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)組成的研究。此外, 通過(guò)檢測(cè)和益生枯草芽孢桿菌共孵育后DCs的抗炎性因子IL-4、IL-10的mRNA表達(dá)情況, 揭示了益生枯草芽孢桿菌對(duì)草魚樹突狀細(xì)胞免疫功能調(diào)控的機(jī)制, 為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。