黃衛(wèi)彤，朱茂靈，覃衛(wèi)娟，王宗杰，廖 旺，曾貴祥

(南寧市婦幼保健院，南寧 530011)

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道耳聾基因GJB2突變引發(fā)兒童非綜合性耳聾概率較高[1]，主要以極重度和重度聽(tīng)力損失為主。我國(guó)人群中GJB2基因最常見(jiàn)的致病突變位點(diǎn)為c.235del C，c.299-300 del AT，c.176-191 del l6和c.35 del G[2]，隨著耳聾基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，近年又相繼發(fā)現(xiàn) GJB2 35 del G，176 del 16，235 del C和299 del AT等新的致病突變位點(diǎn)，而且文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]基因突變位點(diǎn)有地域差別。目前尚未見(jiàn)南寧市針對(duì)新生兒進(jìn)行GJB2全基因測(cè)序的研究報(bào)道,本研究旨在探討南寧市新生兒GJB2致聾基因的突變特點(diǎn)，了解基因攜帶率，篩查出與耳聾相關(guān)的基因突變位點(diǎn)，為制定適于南寧市新生兒耳聾基因篩查方案提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年1月～2018年12月南寧市新生兒疾病篩查中心1 007例聽(tīng)力初篩未通過(guò)的新生兒為研究對(duì)象，經(jīng)知情同意和通過(guò)廣西全民健康信息平臺(tái)查看新生兒基本信息、聽(tīng)力初篩、聽(tīng)力損失確診等資料并跟蹤隨訪GJB基因突變者耳聾情況。聽(tīng)力損失確診方法：聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)及聲導(dǎo)抗檢查。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑盒:DNA提取試劑為北京天根生化科技有限公司，測(cè)序試劑為TAKARA Multiplex PCR Assay Kit ver.2(寶日生物技術(shù)工程有限公司) 。

1.2.2 主要儀器：基因擴(kuò)增儀(ABI 2720),熒光定量PCR儀(ABI 7500)，測(cè)序儀(Miniseq)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：由護(hù)士采集新生兒靜脈血或足跟血，分別制成直徑8mm的3個(gè)血斑濾紙干血片并晾干，保存于-20℃冰箱，留待檢測(cè)。

1.3.2 DNA提取方法：用血片打孔器將血斑打孔得到6mm直徑的干血斑，經(jīng)萃取后，用全血基因組DNA提取試劑提取DNA，用核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度，其最低工作濃度應(yīng)≥5ng/μl。

1.3.3 GJB2基因測(cè)序方法：①文庫(kù)構(gòu)建： PCR擴(kuò)增。② 文庫(kù)純化。③文庫(kù)質(zhì)檢：參照KAPA Library Quantification Kit Illumina platforms TDS對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量。④測(cè)序：將文庫(kù)pooling,變性最終以1.8 pmol/L的文庫(kù)上機(jī)測(cè)序。⑤數(shù)據(jù)分析方法：采用fastQC對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，移除接頭污染以及平均質(zhì)量值低于20測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)于總數(shù)據(jù)量低于1.2 mol/L的樣品或者平均測(cè)序深度低100×的樣品予以重新測(cè)序。運(yùn)用bwa軟件的mem 模型將測(cè)序數(shù)據(jù)與人數(shù)參考基因組(hg19)進(jìn)行比對(duì)后，通過(guò)Picard和GATK等軟件對(duì)樣品的SNV和indel進(jìn)行檢測(cè)，檢出的基因突變采用snpEff軟件進(jìn)行基因注釋和功能,通過(guò)SnpSift軟件和dbNSFP3數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。⑥生物信息學(xué)分析：利用GATK工具判讀SNP和Indel位點(diǎn)；利用Snpeff工具注釋SNP，最后利用dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、HGMD等數(shù)據(jù)庫(kù)、clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋和比較分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，GJB2基因攜帶率以百分率(%)表示，基因突變位點(diǎn)差異性比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。待測(cè)序的GJB2突變位點(diǎn)類型分為已明確的致聾位點(diǎn)、未明確致聾位點(diǎn)(包括新基因位點(diǎn))及多態(tài)性位點(diǎn)三種類型。

2 結(jié)果

GJB2各突變位點(diǎn)、攜帶率及GJB2c.109 G>A攜帶率與其它城市比較結(jié)果分別詳見(jiàn)表1，表2。 1 007例新生兒中GJB2致聾基因攜帶率為55.21%(556/1 007)，共檢測(cè)出GJB2突變位點(diǎn)16個(gè)，其中GJB2 c.109 G>A 突變攜帶率較高，占20.36%，其次是c.79 G>A 占10.03%，c.608 T>C 占7.65%，c.217 C>A 占7.15%，c.341 A>G 占6.85%，其它位點(diǎn)(包括c.11 G>A ，-23+1 G>A， c.235del C， c.299 del AT，c.-121 G>A ，c.464 A>G，c.147 C>G， c.676 G>T ，c.316 T>G ，c.-23-35 G>T和c.368 C>A)突變攜帶率<0.1%。通過(guò)廣西全民健康信息平臺(tái)查看556例GJB2攜帶者基本信息、聽(tīng)力初篩、聽(tīng)力損失確診資料和跟蹤隨訪結(jié)果，有31例確診聽(tīng)力損失(不同程度耳聾)，基因突變致聾率為5.58%。其中檢出GJB2致聾突變位點(diǎn)包括 c.109 G>A(純合子突變)，c.235del C(純合子突變)， c.299 del AT(純合子突變)和c.11 G>Ac(雜合子突變)，分別占耳聾率的83.87%，6.45%，3.23%和6.45%。81例聽(tīng)力確診正常者檢出6個(gè)新突變位點(diǎn)，包括c.-23-35 G>T ，c.-121 G>A ，c.464 A>G， c.217 C>A，c.147 C>G和c.676 G>T。4例檢出1個(gè)未明確致病性位點(diǎn)是c.-23+1 G>A 。250例確診聽(tīng)力正常者攜帶其它5個(gè)突變位點(diǎn)為中國(guó)人群最常見(jiàn)多態(tài)突變位點(diǎn)。GJB2 c.109 G>A攜帶率與北京[5]、臺(tái)灣[6]和上海[7]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=133.364,11.724,32.449,均P<0.05)，與廣東[8]比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.085，P>0.5)。

3 討論

3.1 研究結(jié)果顯示 南寧市新生兒GJB2攜帶率高達(dá)55.21%，基因突變致聾率為5.58%，致聾率與國(guó)內(nèi)報(bào)道基本一致[2]。篩查出4個(gè)致聾突變位點(diǎn)中，c.109 G>A攜帶率最高，與北京、上海等城市比較有地域性差別。GJB2 c.109 G>A純合子突變者均確診為不同程度耳聾，占致聾突變位點(diǎn)的83.87%，與國(guó)內(nèi)外戴翔等報(bào)道比較偏高[4，9]，其次是c.235 delC，c.299 del AT純合子突變和c.11 G>A雜合子突變均可致聾，但比戴翔等報(bào)道[4]攜帶率偏低。說(shuō)明南寧市新生兒攜帶的致聾基因以GJB2 c.109 G>A為主，其它致聾突變位點(diǎn)攜帶率比較低。國(guó)外有報(bào)道[9-11]GJB2 c.-23+1 G>A為致聾位點(diǎn)，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，本研究4例攜帶者為c.-23+1 G>A雜合子突變，聽(tīng)力正常，由于病例少，未檢出純合子突變，需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量檢測(cè)，才能深入研究證實(shí)該位點(diǎn)純合子突變是否致聾。

表1 1 007例新生兒耳聾基因GJB2檢測(cè)各位點(diǎn)突變攜帶率(n=100)

表2GJB2c.109G>A攜帶率與其它城市結(jié)果比較[n(%)]

類別n攜帶率n(%)χ2P值 南寧[本研究]1 007205(20.36)——北京[5]91536(3.93)133.3640.000臺(tái)灣[6]5 173821(15.87)11.7240.001上海[7]1 516181(11.94)32.4490.000廣東[8]53 03310 995(20.73)0.0850.771

3.2 250例攜帶GJB2突變位點(diǎn) 國(guó)內(nèi)報(bào)道[4-5，12]c.368 C>A，c.316 T>G，c.341 A>G，c.79 G>A和c.608 T>C為中國(guó)人群最常見(jiàn)多態(tài)突變，結(jié)合聽(tīng)力確診和追蹤隨訪結(jié)果，攜帶者聽(tīng)力正常，提示以上5個(gè)突變位點(diǎn)攜帶者致聾風(fēng)險(xiǎn)機(jī)率很低。

3.3 GJB2突變的新位點(diǎn)與致病情況 研究有81例檢出6個(gè)新突變位點(diǎn)，包括c.-23-35 G>T ，c.-121 G>A ，c.464 A>G， c.217 C>A，c.147 C>G和c.676 G>T，結(jié)合聽(tīng)力確診和追蹤隨訪結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力損失，但均為雜合子突變，還不能證實(shí)其是否致聾，需要繼續(xù)收集樣本檢測(cè)，才能確定純合子突變與耳聾相關(guān)性。

綜上所述，本研究依據(jù)1 007例南寧市新生兒跟蹤隨訪、聽(tīng)力篩查、確診和高通量測(cè)序血液中GJB2基因突變結(jié)果，篩查出4個(gè)致聾突變位點(diǎn)和6個(gè)新突變位點(diǎn)，1個(gè)未明確致病位點(diǎn)，明確了南寧市新生兒GJB2致聾基因攜帶率較高，致聾突變位點(diǎn)以c.109 G>A純合子突變?yōu)橹?，為制定適合于南寧市新生兒耳聾基因篩查方法和遺傳咨詢提供可靠依據(jù)。