彭 斌， 何 敏， 李正茂， 符 勇， 譚文甫

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院創(chuàng)傷骨科， 湖南 衡陽(yáng) 421002)

骨肉瘤是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年。骨肉瘤惡性程度高，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，即便對(duì)于非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者，其5年生存率也僅為60%～70%[1-2]。輔助化療也不能有效提高生存率[3]。因此仍需開發(fā)新的治療藥物來(lái)改善骨肉瘤的預(yù)后[4]。

組蛋白乙?；寝D(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制，它主要通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。組蛋白的乙?；芙M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyl transferases，HATs)和組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylases, HDACs)的調(diào)節(jié)[5]。HAT催化乙酰基轉(zhuǎn)移到組蛋白的N端賴氨酸殘基，導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象疏松而利于靶基因的轉(zhuǎn)錄，而HDAC恰好相反[6]。某些抑癌基因若發(fā)生HDAC復(fù)合物的異常募集，則可引起其表達(dá)異常而參與腫瘤的發(fā)生,因此，HATs和HDACs是腫瘤治療的重要靶標(biāo)，其相關(guān)藥物在骨肉瘤中的療效也得到了證實(shí)[7-8]。

貝利司他(Belinostat)是Topotarget和Spectrum公司聯(lián)合開發(fā)的一種羥肟酸類HDAC抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACi)，化學(xué)結(jié)構(gòu)上和伏立諾他以及帕比司他屬同類化合物[9]。貝利司他的藥理學(xué)作用和羅米地辛以及普拉曲沙接近，其治療外周T細(xì)胞淋巴瘤的客觀應(yīng)答率(objective response rate, ORR)約為20%[10]。但貝利司他的安全性相對(duì)較高，更適合聯(lián)合用藥。貝利司他在治療外周T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、肝癌和胸腺癌等方面具有較好的療效[11]。但目前尚未有關(guān)于貝利司他在骨肉瘤細(xì)胞增殖方面的研究。本項(xiàng)工作旨在探討貝利司他在骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖中的影響，并觀察其對(duì)多柔比星(doxorubicin; 又稱阿霉素)是否具有協(xié)同效應(yīng)，初步探討其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

貝利司他購(gòu)自Selleck；磷酸化Akt(Ser473)及Akt、糖原合成酶激酶(glycogen synthetase kinase 3β, GSK-3β)、caspase-3、 Bcl-xL及PTEN抗體購(gòu)自Cell Signaling；乙?；M蛋白H3和H4 (Lys5/8/12/16) 多克隆抗體購(gòu)自Millipore；鼠抗人β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與活性檢測(cè) 人骨肉瘤細(xì)胞系SAOS-2、SJSA和U2OS購(gòu)自ATCC。細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1.0×105U/L青霉素，0.1 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法，采用MTT法檢測(cè)貝利司他對(duì)骨肉瘤細(xì)胞活力的影響[12]。即，將細(xì)胞以每孔約2 500個(gè)接種在96孔板中(培養(yǎng)液含10%胎牛血清)。 24 h后，細(xì)胞用0.5、1、2.5和5 μmol/L的貝利司他處理48 h。藥物處理后，將22 μL 5%的MTT試劑加入到每個(gè)孔中，并將細(xì)胞在37 ℃溫育2～4 h。在酶標(biāo)儀上(UV Spectromax M2，Molecular Devices)上測(cè)定570 nm處的吸光度(A)值，并使用CompuSyn軟件計(jì)算貝利司他的IC50值。

2.2細(xì)胞凋亡檢測(cè) 按照Roche提供的In Situ Cell Death Detection試劑盒測(cè)定凋亡后DNA的片段化水平,即用不同濃度的貝利司他處理細(xì)胞48 h后。 獲取約100 000個(gè)細(xì)胞，獲取其裂解上清，酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)下獲取其吸光度。

2.3caspase-3/-7活性測(cè)定 根據(jù)AnaSpec提供的SensolyteTMHomogeneous AMC caspase-3/-7試劑盒測(cè)定caspase-3/-7的活性。即接種在6孔板中的細(xì)胞(約每孔1×105個(gè))用不同濃度貝利司他處理48 h。 孵育結(jié)束后，加入裂解緩沖液至終體積為每孔150 μL，然后將50 μL caspase-3/-7底物試劑加入孔中，并在37 ℃下振蕩溫育30～60 s。最后在熒光酶標(biāo)儀上獲取吸光值，其中Ex/Em=354 nm/442 nm。

2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)及磷酸化水平 收集藥物處理48 h后的細(xì)胞，用PBS漂洗后，加入M-PER蛋白提取試劑(Pierce)充分裂解細(xì)胞。以9 000 ×g離心15 min后，經(jīng)SDS-PAGE分離總蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，將膜與相應(yīng)的Ⅰ抗4 ℃溫育過(guò)夜，然后用TBST洗滌3次后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光(Perkin-Elmer)、顯影，并進(jìn)行灰度掃描。

2.5藥物聯(lián)合分析 使用固定比率法評(píng)估不同貝利司他與阿霉素濃度組合對(duì)骨肉瘤細(xì)胞活力的影響。即，將藥物以4∶1的濃度比(貝利司他：阿霉素)組合并進(jìn)行2倍系列稀釋。分別將其與細(xì)胞孵育后后，按照2.3中的方法測(cè)定細(xì)胞活力。根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法[13]，使用CompuSyn軟件分析各藥物及其組合的劑量-效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)，并計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(combination index, CI)值：CI=1，疊加；CI<1，協(xié)同作用；CI>1，拮抗作用。同時(shí)也計(jì)算了劑量減少指數(shù)(dose reduction index, DRI)，即協(xié)同組合中藥物的劑量與單獨(dú)的相同藥物的劑量相比降低的程度的量度，以實(shí)現(xiàn)給定的效果水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)量3次，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。組間比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 貝利司他抑制骨肉瘤細(xì)胞活力

MTT結(jié)果顯示，0.5、1、2.5和5 μmol/L貝利司他處理U2OS和SAOS-2細(xì)胞48 h后，均可抑制其活力，其IC50值分別為1.136 μmol/L和1.261 μmol/L，見圖1。因SJSA細(xì)胞需要孵育72 h后才能觀察到抑制效果，因此隨后的研究中主要選取U2OS和SAOS-2細(xì)胞為研究對(duì)象。

Figure 1.Effects of Belinostat at different concentrations on the viability of U2OS and SAOS-2 cells.

圖1 不同濃度貝利司他對(duì)U2OS和SAOS-2細(xì)胞活力的影響

2 貝利司他誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡

ELISA結(jié)果顯示，0.5、1和2.5 μmol/L貝利司他能以劑量依賴性方式促進(jìn)U2OS和SAOS-2細(xì)胞DNA片段化，見圖2A。 同時(shí)，貝利司他也能上調(diào)U2OS和SAOS-2細(xì)胞caspase-3/-7酶的活性(P<0.05),見圖2B。此外，Western blot顯示貝利司他處理后，細(xì)胞中cleaved caspase-3含量增多，Bcl-xL的含量減少(P<0.05),見圖2C。

Figure 2.Effect of different concentration of Belinostat on DNA fragmentation (A), caspase-3/-7 activity (B), and cleaved caspase-3 and Bcl-xL expression (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2 貝利司他誘導(dǎo)U2OS和SAOS-2細(xì)胞凋亡

3 貝利司他促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞中組蛋白H3和H4乙?；?/h3>

Western blot結(jié)果顯示，分別采用1和 2.5 μmol/L貝利司他處理SAOS-2和U2OS細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中乙?；M蛋白H3(acetylated histone H3, AcH3)和AcH4表達(dá)水平隨著貝利司他濃度的遞增而增高(P<0.05),見圖3。

4 貝利司他影響AKT通路相關(guān)蛋白磷酸化

Western blot結(jié)果顯示，用1和2.5 μmol/L貝利司他處理48 h后，U2OS和SAOS-2細(xì)胞中磷酸化Akt顯著減少(P<0.05); Akt的直接底物GSK-3β的磷酸化水平也顯著降低(P<0.05);此外，1和2.5 μmol/L貝利司他孵育對(duì)U2OS和SAOS-2細(xì)胞系中PTEN蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.Effect of Belinostat on the acetylation of histones H3 and H4 in U2OS and SAOS-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖3 貝利司他對(duì)U2OS和SAOS-2細(xì)胞中組蛋白H3和H4乙?；挠绊?/p>

Figure 4.Effect of Belinostat on the expression and phosphorylatin of Akt pathway-related proteins in U2OS and SAOS-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4 貝利司他對(duì)U2OS和SAOS-2細(xì)胞中Akt通路相關(guān)蛋白磷酸化的影響

5 貝利司他增強(qiáng)阿霉素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的毒性作用

MTT結(jié)果顯示，貝利司他和阿霉素以固定濃度比組合孵育U2OS和SAOS-2細(xì)胞后，隨著劑量的增加，細(xì)胞活力逐漸降低，見圖5。通過(guò)CI和DRI的計(jì)算顯示，由于貝利司他與阿霉素之間的協(xié)同作用，其在U2OS細(xì)胞中的IC50值可分別降低為原來(lái)的41%和19%，在SAOS-2細(xì)胞中分別降低為原來(lái)的58%和24%，見圖5、表1。

Figure 5.Effect of different concentration of Belinostat on U2OS and SAOS-2 cells viability. Mean±SD.n=3.

圖5 不同濃度貝利司他協(xié)同阿霉素抑制U2OS和SAOS-2細(xì)胞活力

表1 貝利司他與阿霉素處理骨肉瘤細(xì)胞的聯(lián)合指數(shù)

Table 1.Combination index (CI) values of Belinostat and doxorubicin at the indicated effective dose (ED) in osteosarcoma cell lines

Cell lineED50ED75ED90ED95U2OS0.720.460.630.85SAOS-20.890.670.140.04

討 論

DNA甲基化和組蛋白乙?；羌?xì)胞中重要表觀遺傳機(jī)制[14]。HDACi通過(guò)促進(jìn)組蛋白乙?；瘉?lái)調(diào)節(jié)染色質(zhì)的緊密程度，最終影響細(xì)胞增殖分化、周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、遷移和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)[15]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞對(duì)HDACi更敏感[16]。貝利司他是2014年FDA批準(zhǔn)上市的一種HDACi，主要用于治療外周T細(xì)胞淋巴瘤。研究表明，貝利司他可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)不受多重耐藥表型的影響，此外貝利司他也可以增強(qiáng)多西他賽或卡鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制效果[17]。在本研究中，我們研究了貝利司對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。MTT結(jié)果顯示，不同的骨肉瘤細(xì)胞系，貝利司他對(duì)其生長(zhǎng)抑制情況有所不同，在敏感的U2OS和SAOS-2細(xì)胞系中，貝利司他可抑制其活力。為了明確貝利司他是否也能影響骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，隨后通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞DNA片段化和caspase-3/-7的活性以間接證實(shí)其促凋亡效應(yīng),結(jié)果顯示，細(xì)胞活力降低的同時(shí)也伴有凋亡的增加。HDACi的抗腫瘤效應(yīng)通常是通過(guò)增加組蛋白乙?；瘡亩淖兓蜣D(zhuǎn)錄水平的。因此，我們檢測(cè)了HDACi處理后骨肉瘤細(xì)胞中乙?；M蛋白的水平，結(jié)果顯示貝利司他可增加骨肉瘤細(xì)胞系中的組蛋白乙?；?，此外，還能抑制Akt的磷酸化，表明貝利司他體外對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有多效性。

本研究同時(shí)也顯示，盡管貝利司他誘導(dǎo)組蛋白乙?；?、抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所需的濃度較低，但和阿霉素共同作用于U2OS和SAOS-2細(xì)胞后，與貝利司他或阿霉素單獨(dú)孵育相比，細(xì)胞活力顯著降低，根據(jù)每種細(xì)胞系的單一藥物處理和組合處理后產(chǎn)生的劑量-效應(yīng)數(shù)據(jù)計(jì)算出藥物的CI值后發(fā)現(xiàn)，貝利司他/阿霉素組合具有協(xié)同效應(yīng)，兩者聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞IC50值顯著降低，與其他研究類似。如HDACi丙戊酸在生理濃度下不影響骨肉瘤細(xì)胞的活性，但能增強(qiáng)其對(duì)阿霉素的敏感型，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也具有類似的效果[18]。

總之，本研究表明貝利司他能抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并能協(xié)同阿霉素進(jìn)一步抑制細(xì)胞活力。在未來(lái)研究中，將開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)一步優(yōu)化兩者之間的劑量組合，從而為骨肉瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。