郝肖瓊， 李延康， 付旭陽(yáng)， 賈方毅

(1包頭醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 2內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014040)

在排卵前卵泡中，卵泡壁層顆粒細(xì)胞表達(dá)的C型利尿鈉肽(C-type natriuretic peptide, NPPC)與表達(dá)在卵丘顆粒細(xì)胞中的利尿鈉肽受體2(natriuretic peptide receptor 2, NPR2)結(jié)合，產(chǎn)生的環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)通過(guò)縫隙連接進(jìn)入卵母細(xì)胞，維持了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的阻滯[1]。在每個(gè)生殖周期中，由下丘腦垂體前葉釋放的促黃體素(luteinizing hormone, LH)激活卵泡壁層顆粒細(xì)胞中的促黃體素受體(luteinizing hormone receptor, LHR)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。激活LHR能夠降低NPPC mRNA的表達(dá)，同時(shí)降低了NPPC蛋白的含量[2]，而我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，在NPPC存在的情況下，LH可通過(guò)降低NPR2活性誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)[3]，這表明在減數(shù)分裂恢復(fù)過(guò)程中，NPR2的失活起著至關(guān)重要的作用。LH本質(zhì)上通過(guò)促進(jìn)顆粒細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)的表達(dá)轉(zhuǎn)激活卵丘細(xì)胞中的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)發(fā)揮作用[4]。我們近期的研究表明，LH-EGFR信號(hào)動(dòng)員內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)升高了卵丘細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平，導(dǎo)致NPR2與NPPC的親和性降低，使NPR2失活，卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂[3]；早期也有研究表明，在穩(wěn)定表達(dá)NPR2的293T細(xì)胞系中，鈣離子能夠降低NPR2的磷酸化水平，使NPR2失活[5]。這些結(jié)果說(shuō)明鈣離子在降低NPR2活性的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，然而，LH-EGFR信號(hào)究竟怎樣升高卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，目前還不清楚。

細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)儲(chǔ)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜系統(tǒng)中，胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放是由多種通路調(diào)控的，磷脂酰肌醇信號(hào)通路是十分重要的一種，許多胞外刺激物可激活磷脂酰肌醇信號(hào)通路，導(dǎo)致1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, IP3R)介導(dǎo)鈣庫(kù)釋放鈣離子[6]。IP3R是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子釋放通道[7]，廣泛表達(dá)于基本所有類型的細(xì)胞中[8]。由IP3R調(diào)節(jié)的鈣離子釋放過(guò)程對(duì)許多胞內(nèi)活動(dòng)十分重要,如基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、受精、發(fā)育、細(xì)胞凋亡細(xì)胞間通訊和激素分泌等[9]。

在本研究中，我們證明了LH-EGFR信號(hào)通路通過(guò)IP3R升高卵丘細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平，從而使NPR2失活，cGMP下降，導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

21～23日齡(12～14 g)雌性C57BL/6J小鼠共150只，全部用于注射孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)，之后取卵巢內(nèi)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(cumulus-oocyte complexes, COCs)用于實(shí)驗(yàn)。小鼠購(gòu)于中科院遺傳所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK (京) 2015-0019，于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)，22～24 ℃恒溫，12 h/12 h交替光照/黑暗，自由采食飲水。

2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

PMSG(浙江寧波激素廠);NPPC、EGF、2-氨乙基二苯基硼酸酯(2-aminoethyl diphenyl borate, 2-APB)、肝素(heparin)和LH(Sigma)；Fluo 3-AM(日本同仁化學(xué)研究所)；MEMα粉末狀培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(FBS;Thermo)；RNA提取試劑盒RNeasy Micro Kit和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒QuantiTect (Qiagen)；TransStart Green qPCR SuperMix(全式金公司)；cGMP檢測(cè)試劑盒(Cayman)。

體式鏡 (Lecia)；A1激光共聚焦顯微鏡(Nikon)；real-time PCR儀(Appiled Biosystems)；細(xì)胞培養(yǎng)膜(Millipore)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1COCs的分離及培養(yǎng) 小鼠腹腔注射PMSG,每只5 U，44～48 h后頸椎脫臼處死，分離卵巢，刺破卵泡，挑選形態(tài)良好，卵丘細(xì)胞包裹均勻的COCs。實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照(control)組(僅添加30 nmol/L NPPC)、NPPC+10 μg/L EGF組、NPPC+10 μg/L EGF+不同劑量2-APB組、NPPC+10 μg/L EGF+不同劑量Heparin組、10 μmol/L 2-APB組以及200 mg/L heparin組，將COCs置于按實(shí)驗(yàn)分組不同預(yù)先添加了不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)4 h后，將卵丘細(xì)胞去掉，觀察并統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)的百分率(GVBD%)，卵母細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯生發(fā)泡(germinal vesicle, GV)即認(rèn)為發(fā)生GVBD，GVBD%代表卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)情況。每次實(shí)驗(yàn)每組使用30枚COCs。

3.2卵泡的分離及培養(yǎng) 卵巢取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，用1 mL注射器分離卵泡，選擇直徑約為300～400 μm、反應(yīng)良好的卵泡，將分離好的卵泡置于孔徑0.44 μm的細(xì)胞培養(yǎng)膜上。實(shí)驗(yàn)分為4組：control組、1 mg/L LH組、 LH+10 μmol/L 2-APB組以及LH+200 mg/L heparin組。培養(yǎng)膜懸浮放置在按實(shí)驗(yàn)分組不同預(yù)先添加不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；4 h后，刺破卵泡，將卵丘細(xì)胞去掉以觀察卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)情況。每次實(shí)驗(yàn)每組使用15枚卵泡。

3.3卵丘擴(kuò)展 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實(shí)驗(yàn)分為4組：control組(僅添加30 nmol/L NPPC)、NPPC+10 μg/L EGF組、NPPC+10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB以及NPPC+10 μg/L EGF+200 μmol/L heparin組。MEMα培養(yǎng)液按處理組不同預(yù)先添加不同試劑待用，各組培養(yǎng)液額外添加5% FBS幫助細(xì)胞貼壁；吸取按不同實(shí)驗(yàn)處理組準(zhǔn)備好的添加了不同試劑的培養(yǎng)液制作微滴，每個(gè)微滴體積10 μL，微滴置于玻底培養(yǎng)皿中以便后續(xù)拍照記錄，將COCs置于不同處理組的微滴中，覆蓋石蠟油，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；12～16 h后結(jié)束培養(yǎng)，觀察卵丘擴(kuò)展情況。每次實(shí)驗(yàn)每組使用15枚COCs。

3.4RNA的提取 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實(shí)驗(yàn)分組同3.3，COCs置于按實(shí)驗(yàn)分組不同預(yù)先添加不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中培養(yǎng)，6 h后，收集COCs，總RNA提取依照RNeasy Micro Kit操作指南進(jìn)行，總RNA的反轉(zhuǎn)錄依照QuantiTect反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行，得到cDNA。

3.5real-time PCR 采用25 μL體系：TransStart Green qPCR SuperMix 12.5 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，Dye 0.5 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 2 μL。在ABI 7500 Real-Time PCR系統(tǒng)下進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

F: forward; R: reverse.

3.6細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平檢測(cè) COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實(shí)驗(yàn)分組同3.3，COCs置于按實(shí)驗(yàn)分組不同預(yù)先添加不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 h，PBS清洗，加入5 μmol/L鈣離子熒光探針Fluo 3-AM，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育20 min，之后PBS清洗，在A1激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，綠色熒光表示胞內(nèi)鈣離子水平，熒光強(qiáng)度代表胞內(nèi)鈣離子水平相對(duì)值。每次實(shí)驗(yàn)每組使用15枚COCs。

3.7cGMP水平檢測(cè) COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實(shí)驗(yàn)分組同3.3，COCs置于按實(shí)驗(yàn)分組不同預(yù)先添加不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中培養(yǎng)(每組需100枚COCs)，2 h后結(jié)束培養(yǎng)，PBS清洗，收集各組COCs，cGMP含量依據(jù)cGMP酶聯(lián)免疫試劑盒(Cayman)中提供的方法進(jìn)行檢測(cè)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，統(tǒng)計(jì)推斷采用方差分析(ANOVA)和SNK-q檢驗(yàn)，用SigmaPlot 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制EGF誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)

IP3R是一種調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)鈣離子釋放的重要通道。我們研究了EGF是否通過(guò)IP3R升高胞內(nèi)鈣離子水平。結(jié)果表明，EGF促進(jìn)了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，GVBD%為(91.42±0.72)%，而IP3R的抑制劑2-APB和heparin能有效抑制EGF誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)(P<0.05)，GVBD%分別為(52.58±1.45)%和(47±1.22)%,見(jiàn)圖1A；且2-APB與Heparin的抑制作用是劑量依賴性的,見(jiàn)圖1B、C。這些結(jié)果表明，IP3R在EGF誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。

2 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制EGF誘導(dǎo)的卵丘擴(kuò)展

EGF在誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的過(guò)程中伴隨著卵丘擴(kuò)展，卵丘擴(kuò)展對(duì)于卵子的正常受精至關(guān)重要。因此，我們檢測(cè)了2-APB及heparin在EGF誘導(dǎo)的卵丘擴(kuò)展中的作用。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，EGF促進(jìn)了卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展與卵丘擴(kuò)展因子的表達(dá)，而2-APB及heparin均能顯著抑制EGF誘導(dǎo)的卵丘擴(kuò)展現(xiàn)象，且卵丘擴(kuò)展因子Has2、Ptgs2、Ptx3與Tnfaip6的表達(dá)量較EGF組均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。這一結(jié)果表明IP3R也參與了EGF誘導(dǎo)的卵丘擴(kuò)展。EGF誘導(dǎo)減數(shù)分裂恢復(fù)與卵丘擴(kuò)展往往并行，且有研究表明，鈣離子在卵丘擴(kuò)展過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[10]。本結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了IP3R在減數(shù)分裂恢復(fù)過(guò)程中的重要意義。

Figure 1.The effect of 2-APB and heparin on EGF-induced meiotic resumption. A: COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin; B: the dose-dependent effects of 2-APB on oocyte meiotic resumption; C: the dose-dependent effects of he-parin on oocyte meiotic resumption. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group;△P<0.05vs2-APB group;▲P<0.05vsheparin group.

圖1 2-APB及heparin對(duì)EGF誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的影響

3 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制EGF誘導(dǎo)的卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高

激活I(lǐng)P3R鈣離子通道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高，接下來(lái)我們研究了2-APB和heparin對(duì)EGF誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子水平升高的影響，鈣離子探針Fluo 3-AM作為胞內(nèi)鈣離子水平變化的指示劑。研究結(jié)果表明，對(duì)照組鈣離子熒光(綠色熒光)強(qiáng)度微弱，添加EGF后，卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度明顯增加，這與之前的研究[11]結(jié)果相同，接著，我們添加了2-APB和heparin，發(fā)現(xiàn)這2種抑制劑均能明顯抑制EGF誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子水平升高，且鈣離子熒光強(qiáng)度也顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖3。這些結(jié)果表明，EGF可能通過(guò)激活I(lǐng)P3R鈣離子通道導(dǎo)致卵丘胞內(nèi)鈣離子水平升高，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，若阻斷IP3R的作用，則EGF不能誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子水平的升高，那么卵母細(xì)胞也無(wú)法恢復(fù)減數(shù)分裂。

4 IP3R抑制劑2-APB和heparin對(duì)COCs中cGMP水平的影響

NPPC處理后COCs中cGMP水平是否升高能夠代表NPR2鳥苷酸環(huán)化酶的活性，卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，本質(zhì)上是高水平的鈣離子導(dǎo)致了NPR2的失活，使cGMP水平下降。因此，我們研究了2-APB和heparin在EGF誘導(dǎo)減數(shù)分裂恢復(fù)過(guò)程中對(duì)COCs內(nèi)cGMP水平的影響。同之前的研究[1]結(jié)果一致，NPPC處理2 h后，COCs中cGMP含量明顯上升，添加EGF降低了胞內(nèi)cGMP水平(P<0.05)，然而，EGF的降低作用能夠被2-APB和heparin顯著逆轉(zhuǎn)(P<0.05),見(jiàn)圖4。這一結(jié)果表明，EGF通過(guò)IP3R升高卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，最終誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。

Figure 2.The effect of 2-APB and heparin on EGF-enabled cumulus expansion.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin. A: morphological changes of cumulus expansion with different treatments after 12～16 h of culture; B: real-time PCR results forHas2,Ptgs2,Ptx3andTnfaip6in cumulus cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖2 2-APB及heparin對(duì)EGF誘導(dǎo)的卵丘擴(kuò)展的影響

Figure 3.The effect of 2-APB and heparin on EGF-mediated calcium elevation.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin.Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖3 2-APB及Heparin對(duì)EGF誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高的影響

Figure 4.The effect of 2-APB and heparin on cGMP level in COCs.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖4 2-APB及heparin對(duì)COCs內(nèi)cGMP水平的影響

5 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制LH誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)

前面的研究中，我們?cè)贑OCs體外培養(yǎng)模型下，證明EGF通過(guò)IP3R升高胞內(nèi)鈣離子水平，使NPR2失活，導(dǎo)致cGMP水平的下降，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)。為了進(jìn)一步模擬生理環(huán)境，我們使用卵泡培養(yǎng)模型，探究IP3R在LH誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)過(guò)程中是否發(fā)揮作用。研究結(jié)果表明，LH促進(jìn)減數(shù)分裂的恢復(fù)，GVBD%為(91.00±1.15)%，而2-APB和heparin顯著抑制了LH誘導(dǎo)的減數(shù)分裂恢復(fù)(P<0.05)，GVBD%分別(51.33±1.45)%和(46.75±0.94)%，見(jiàn)圖5。LH本質(zhì)上通過(guò)激活EGFR發(fā)揮作用，因此，本結(jié)果證明LH-EGFR信號(hào)確實(shí)通過(guò)IP3R升高胞內(nèi)鈣離子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，減數(shù)分裂恢復(fù)。

討 論

排卵前卵泡中的卵母細(xì)胞一直阻滯在減數(shù)分裂I前期的雙線期，NPPC與其受體NPR2結(jié)合，產(chǎn)生的cGMP是維持減數(shù)分裂阻滯的關(guān)鍵因子[1]，LH通過(guò)促進(jìn)顆粒細(xì)胞中EGF樣生長(zhǎng)因子的表達(dá)[12]，轉(zhuǎn)激活卵丘細(xì)胞中的EGFR，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂[4]。前期的研究表明，激活EGFR升高卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，導(dǎo)致NPR2與NPPC的親和性下降，使NPR2失活，cGMP水平下降，卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LH-EGFR信號(hào)通過(guò)IP3R升高卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。

Figure 5.The effect of 2-APB and heparin on LH-induced meio-tic resumption. Follicles were cultured with MEMα medium alone, or supplemented with 1 mg/L LH, 1 mg/L LH+10 μmol/L 2-APB or 1 mg/L LH+200 mg/L heparin. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖5 2-APB及heparin對(duì)LH誘導(dǎo)的減數(shù)分裂恢復(fù)的影響

細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)作為調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的重要信使，參與了多種細(xì)胞生理反應(yīng)。胞內(nèi)高水平鈣離子一方面來(lái)源于質(zhì)膜鈣泵的開(kāi)放，使胞外鈣離子內(nèi)流，另一方面來(lái)源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的釋放。我們前期的研究已經(jīng)證明，激活EGFR升高卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，而EGF誘導(dǎo)的卵丘細(xì)胞內(nèi)高水平鈣離子來(lái)源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的釋放[3]。IP3R和蘭尼堿受體(ryano-dine receptor, RyR)均為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放通道，我們發(fā)現(xiàn)RyR的抑制劑tetracaine并不能抑制EGF誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)(結(jié)果未顯示)，然而，IP3R的抑制劑2-APB和heparin卻能劑量依賴性的抑制EGF誘導(dǎo)的減數(shù)分裂恢復(fù)，此外，2-APB和heparin有效抑制了EGF升高的卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，鈣離子水平的升高是EGF促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)的關(guān)鍵原因。這些結(jié)果表明IP3R在EGF誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)中發(fā)揮作用，EGF激活I(lǐng)P3R鈣離子通道，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放鈣離子，導(dǎo)致了卵丘細(xì)胞內(nèi)具有高水平鈣離子。然而，2-APB和heparin并不能完全逆轉(zhuǎn)EGF誘導(dǎo)的減數(shù)分裂恢復(fù)，提示可能還有其它互補(bǔ)途徑，這需要進(jìn)一步的研究。

我們發(fā)現(xiàn)2-APB和heparin同樣能夠抑制EGF誘導(dǎo)的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的時(shí)空調(diào)控對(duì)于正常的排卵進(jìn)程至關(guān)重要，而激活I(lǐng)P3R鈣離子通道升高了胞內(nèi)鈣離子水平，說(shuō)明鈣離子可能也參與了EGF誘導(dǎo)的卵丘擴(kuò)展，這與之前的報(bào)道一致[10]，同時(shí)，這些結(jié)果也表明了鈣離子對(duì)減數(shù)分裂的作用不僅是單一的促成熟，還能夠促進(jìn)卵丘擴(kuò)展，鈣離子的這些作用能夠確保卵子正常的成熟與排卵。

EGF通過(guò)IP3R升高卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，而鈣離子的重要意義在于使NPR2失活，導(dǎo)致cGMP水平下降，最終破壞卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的阻滯狀態(tài)[13-14]。2-APB和heparin不但抑制了EGF誘導(dǎo)的卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高，還能夠有效逆轉(zhuǎn)EGF介導(dǎo)的胞內(nèi)cGMP水平降低，這說(shuō)明IP3R介導(dǎo)的卵丘細(xì)胞內(nèi)高水平鈣離子導(dǎo)致了NPR2的失活，使cGMP水平下降，最終促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。之前的結(jié)果表明鈣離子可使NPR2失活[15]，我們的結(jié)果也與之一致。

由于卵丘細(xì)胞不表達(dá)LH受體，因此，LH主要通過(guò)激活卵丘細(xì)胞中的EGFR發(fā)揮作用，2-APB和he-parin同樣抑制了LH誘導(dǎo)的減數(shù)分裂恢復(fù)，之前的研究表明LH處理升高了卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平導(dǎo)致NPR2失活[3]，結(jié)合此結(jié)果，說(shuō)明LH-EGFR信號(hào)通過(guò)IP3R升高卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，高水平鈣離子使NPR2失活，cGMP水平下降，最終誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。

本研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的分子機(jī)理，為臨床輔助生殖中建立更為完善的卵母細(xì)胞體外成熟體系、提高卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院張美佳教授在論文寫作過(guò)程中給予的指導(dǎo)。