徐衛(wèi)衛(wèi)， 伍聰聰， 王笑笑， 簡久瑩， 楊又璇， 張 妮， 郭 兵， 劉麗榮△

(1貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床血液學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004； 2貴陽市第一人民醫(yī)院輸血科， 3貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床上危重癥常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，發(fā)生率和死亡率均較高，并有逐年增高趨勢[1-2]。AKI由多種病因造成，其中缺血再灌注(ischemia/reperfusion，IR)引起AKI是臨床上最常見的發(fā)病原因之一[3]。盡管經(jīng)過多年研究，目前對IR引起的AKI仍缺乏有效的預(yù)防和治療措施。因此，進(jìn)一步研究IR誘導(dǎo)AKI的發(fā)病機(jī)制及有效的治療措施至關(guān)重要。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，表觀遺傳學(xué)參與了腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展過程，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用[4-5]。組蛋白甲基化是目前研究較廣泛深入的表觀遺傳修飾方式之一，是指組蛋白在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生甲基化修飾的過程，通過影響組蛋白與DNA的親和性來改變?nèi)旧w空間結(jié)構(gòu)及狀態(tài)，調(diào)控基因的表達(dá)[6]。組蛋白不同位點(diǎn)的甲基化由不同的甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成[7],如組蛋白H3第36位賴氨酸(histone H3 lysine 36，H3K36)可由N-賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD2(SET and MYND domain containing 2)催化發(fā)生三甲基化(H3K36me3)。在常染色體顯性多囊腎患者和小鼠的腎上皮細(xì)胞中，SMYD2催化組蛋白H3K36和多種信號蛋白甲基化參與了腎囊腫生成和細(xì)胞凋亡[8]。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set2介導(dǎo)的H3K36me3在DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)處富集，促進(jìn)DSB修復(fù),減輕組織或細(xì)胞損傷[9],但H3K36me3是否參與AKI的發(fā)生與發(fā)展目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，多種表觀遺傳修飾參與了AKI的發(fā)生與發(fā)展[10]，故本研究通過觀察H3K36me3在IR誘導(dǎo)的AKI小鼠腎組織中的表達(dá)變化，分析其與腎組織SMYD2及腎損傷程度的相關(guān)性，旨在探討H3K36me3在IR-AKI中的作用及其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性ICR小鼠，體重18～20 g，周齡8周，購買于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(京)2016-0002，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水、攝食。

1.2主要器械、儀器及試劑 雙垂直電泳儀(北京六一，DYCZ-24DN)；全波長酶標(biāo)儀(BIO-RAD，V111584)；高速離心機(jī)(BECKMAN Allegra X-30R Centrifuge)；自動生化分析儀(Cobas, c702)；旋渦振蕩器(杭州米歐，MIX-28+)；光學(xué)顯微鏡(耐博，M-30D)。蛋白提取試劑盒(Solarbio，R0010)；BCA定量試劑盒(碧云天，P0010S)；免疫組化試劑盒(Bioss，SP-0023)；DAB顯色試劑盒(Bioss；C02-04001)。抗體：β-actin(Bioss，bs-0061R)；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL；Boster，PB0641)；H3K36me3(Abcam，ab9050)；P53(Wanleibio，WL01919)；p-P53(Wanleibio，WL02504)；促凋亡因子Bax(Wanleibio，WL01637)；抗凋亡因子Bcl-2(Wanleibio，WL01556)；cleaved caspase-3(Santa，sc7272)；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcripition 3，STAT3;Abcam，ab68153)；p-STAT3(Abcam，ab76315);c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK;Abcam，ab179461);p-JNK1/2/3 (Abcam，ab124956)。

2 方法

2.1IR誘導(dǎo)AKI小鼠模型的構(gòu)建 將30只ICR小鼠隨機(jī)分為IR組和假手術(shù)(sham)組。術(shù)前禁食8 h，自由飲水。腹腔注射戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉，固定、備皮、消毒，沿腹中線左右各0.5 cm分別作縱行切口，暴露雙側(cè)腎臟鈍性剝離腎蒂。微動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，1 min內(nèi)可見腎臟由鮮紅色變?yōu)樽虾谏?。夾閉45 min后，松開微動脈夾恢復(fù)血流灌注，觀察腎臟顏色變?yōu)轷r紅色，縫合腹腔。sham組僅鈍性剝離腎蒂，其余與IR組做相同處理。

2.2標(biāo)本收集 小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食24 h。乙醚麻醉后眼眥取血，分離血清檢測腎功能指標(biāo)。開腹留取雙側(cè)腎臟，1/2腎臟置于4%多聚甲醛中固定，用于腎組織病理分析；其余1/2腎臟置于-80 ℃冰箱中儲存，用于提取總蛋白和后續(xù)檢測。

2.3生化方法檢測腎功能指標(biāo)血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr) 將全血置于低速離心機(jī)4 000 r/min離心5 min，取上清，應(yīng)用Cobas 702全自動生化分析儀檢測各組小鼠BUN和Scr含量。

2.4HE染色觀察腎組織病理學(xué)的改變 采用4%多聚甲醛固定腎組織，脫水浸蠟，石蠟包埋，制成3 μm厚的石蠟切片，脫蠟透明后行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.5免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色檢測腎組織中NGAL和cleaved caspase-3的變化 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)，3% H2O2滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶20 min，正常山羊血清工作液封閉30 min，孵育 I 抗4 ℃過夜，室溫復(fù)溫30 min，室溫孵育 II 抗30 min，DAB顯色，顯微鏡觀察，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，自來水返藍(lán)，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察NGAL和cleaved caspase-3的變化情況。

2.6Western blot檢測腎組織中NGAL、SMYD2、H3K36me3、p-P53、P53、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、STAT3、p-STAT3、JNK和p-JNK1/2/3等蛋白水平的變化 稱取0.020 g腎組織加入蛋白裂解液充分研磨裂解，4 ℃離心20 min取上清，應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度，配制蛋白樣本。配制SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入 I 抗：NGAL(1∶800)、SMYD2(1∶500)、H3K36me3(1∶1 000)、p-P53(1∶500)、P53(1∶500)、Bax(1∶750)、Bcl-2(1∶500)、cleaved caspase-3(1∶300)、p-STAT3(1∶2 000)、STAT3(1∶1 500)、JNK(1∶1 000)、p-JNK1/2/3(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，孵育相應(yīng)II抗，TBST洗膜，ECL顯影曝光，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，ImageJ 1.6軟件進(jìn)行分析各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，目的蛋白與β-actin的比值進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腎功能變化

與sham組相比，IR組的BUN和SCr水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 小鼠BUN和SCr水平

Table 1.The results of BUN and SCr in each group (Mean±SD.n=15)

GroupBUN (mmol/L)SCr (μmol/L)sham5.48±0.847.13±1.36IR65.02±6.22*157.50±9.07*

*P<0.05vssham group.

2 腎組織病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，sham組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞未見明顯水腫、脫落和壞死；IR組可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹、脫落、壞死，腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落，管腔內(nèi)大量細(xì)胞碎屑?xì)埩?，腎小球未見明顯病變，見圖1。

Figure 1.The pathophysiological changes in the kidney of mice (HE staining). The green arrow indicates edema of renal epithelial cells; the red arrow indicates the fragments of renal epithelial cells.

圖1 小鼠腎組織病理學(xué)改變

3 腎組織中NGAL和cleaved caspase-3的變化

IHC染色結(jié)果顯示，與sham組相比，IR組腎小管上皮細(xì)胞中NGAL和cleaved caspase-3明顯增多，見圖2。

4 腎組織NGAL、SMYD2、H3K36me3、p-P53、P53、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-STAT3、STAT3、JNK和p-JNK1/2/3等蛋白水平的變化

Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，IR組NGAL、SMYD2和H3K36me3的蛋白水平明顯增加(P<0.05)，見圖3。IR組的p-P53、cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平明顯增加(P<0.05), Bcl-2表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，P53表達(dá)水平不變，見圖4。IR組的STAT3、p-STAT3、JNK和 p-JNK1/2/3的蛋白水平均明顯增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 2.The expression of NGAL and cleaved caspase-3 proteins in the kidney of mice detected by immunohistochemical staining (×200).

圖2 小鼠腎組織NGAL和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

5 腎組織 H3K36me3同SMYD2和NGAL相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示,腎組織H3K36me3同SMYD2和NGAL的變化水平均呈顯著正相關(guān)，H3K36me3與SMYD2的相關(guān)系數(shù)r=0.946(P<0.05);H3K36me3與NGAL的相關(guān)系數(shù)r=0.887(P<0.05)。

討 論

AKI作為各種大型手術(shù)和器官移植常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，如何有效的預(yù)防和治療成為了國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。越來越多的研究表明[11]，表觀遺傳修飾與AKI的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，因此，進(jìn)一步研究表觀遺傳修飾在AKI發(fā)生發(fā)展中的作用，將為AKI的防治提供新的方向。

Figure 3.The protein levels of NGAL, SMYD2 and H3K36me3 in the kidney of mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vssham group.

圖3 小鼠腎組織中NGAL、SMYD2和H3K36me3蛋白水平的變化

研究表明，在腎IR 24 h后，腎組織中的NGAL表達(dá)明顯增加，提示NGAL可作為AKI早期診斷的標(biāo)志物[12]。本研究結(jié)果顯示，在IR誘導(dǎo)AKI小鼠腎組織中NGAL表達(dá)明顯增加(P<0.05)，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致[13],同時結(jié)合本研究中小鼠腎功能及腎組織形態(tài)學(xué)改變結(jié)果提示，IR-AKI小鼠模型構(gòu)建成功。研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)腎臟纖維化的小鼠腎組織中H3K9me1表達(dá)上調(diào)[14]，IR誘導(dǎo)的腎損傷小鼠腎組織中H3K4me3表達(dá)上調(diào)[15]，提示組蛋白甲基化水平增高可能與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在IR誘導(dǎo)AKI小鼠腎組織中，H3K36me3和SMYD2表達(dá)明顯增加，同時伴有小鼠腎功能障礙，腎小管上皮細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡增加，提示H3K36me3表達(dá)上調(diào)可能參與了IR-AKI腎損傷的發(fā)生。目前關(guān)于H3K36me3在IR-AKI發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制尚未見其他研究報(bào)道。

Figure 4.The protein levels of p-P53， P53， cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 in the kidney of mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vssham group.

圖4 小鼠腎組織中p-P53、P53、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的變化

AKI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，參與因素和涉及事件眾多，包括腎近端小管損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[16]。腎近端小管損傷涉及不同的病理反應(yīng)，主要包括炎癥、細(xì)胞凋亡、壞死和線粒體功能障礙等[17]。本研究結(jié)果表明，sham組小鼠腎組織中未出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡，IR組小鼠腎組織中凋亡細(xì)胞明顯增加，且伴有腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落，管腔內(nèi)大量細(xì)胞碎屑?xì)埩簦I組織損傷明顯，提示腎IR損傷時，細(xì)胞凋亡明顯增加，參與介導(dǎo)了AKI的發(fā)生。細(xì)胞凋亡受多種凋亡基因及凋亡蛋白的調(diào)控，P53是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡重要的調(diào)控基因之一[18]。研究表明，在腎IR損傷時，P53蛋白表達(dá)增加，可激活凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡相關(guān)蛋白BCL-2蛋白的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果表明，在IR-AKI小鼠腎組織中p-P53蛋白及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和Bax表達(dá)明顯增加，抗凋亡蛋白BCL-2蛋白表達(dá)明顯下降，提示IR-AKI時，腎組織中P53表達(dá)增加，可能參與介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。

大量研究表明，當(dāng)腎IR損傷時可激活一系列細(xì)胞凋亡信號通路[20-22]，包括P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路和非P53依賴的細(xì)胞凋亡信號通路。本研究結(jié)果表明，在腎IR損傷時，腎組織中p-P53、p-STAT3和p-JNK1/2/3的蛋白水平明顯增加，提示IR-AKI時，腎組織中P53表達(dá)增加，可能同時激活了STAT3和JNK相關(guān)的細(xì)胞凋亡信號通路，介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。另外，Li LX等研究發(fā)現(xiàn)，SMYD2和H3K36me3的上調(diào)可導(dǎo)致STAT3在賴氨酸685處甲基化，然后磷酸化進(jìn)而活化，以調(diào)節(jié)囊性腎上皮細(xì)胞凋亡，藥物干預(yù)可減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8]，但H3K36me3在IR-AKI腎損傷及腎組織細(xì)胞凋亡中的作用目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，H3K36me3與SMYD2和NGAL的水平均呈明顯正相關(guān)，結(jié)合上述結(jié)果，提示H3K36me3表達(dá)的上調(diào)可能受SMYD2的調(diào)控，其可能參與了STAT3或JNK介導(dǎo)的IR-AKI腎損傷及腎組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Figure 5.The protein levels of STAT3, p-STAT3, JNK and p-JNK1/2/3 in the kidney of mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vssham group.

圖5 小鼠腎組織中STAT3、p-STAT3、JNK和p-JNK1/2/3蛋白水平變化

綜上所述，在IR誘導(dǎo)小鼠AKI腎組織中H3K36me3表達(dá)上調(diào)，且與腎臟損傷及腎組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)，H3K36me3可能與STAT3/JNK信號通路活化共同參與調(diào)控IR所致細(xì)胞凋亡發(fā)生進(jìn)而導(dǎo)致AKI的發(fā)生過程，但具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。