毛 凌， 陸光金， 唐清清， 李小紅， 任啟旭， 韓 勇， 陳遠(yuǎn)壽

(遵義醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 貴州 遵義 563000)

20-羥二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid, 20-HETE)是由細(xì)胞色素P-450催化花生四烯酸ω-羥基生成的血管活性物質(zhì)。動物實驗及臨床研究表明20-HETE具有促使血管平滑肌收縮、誘導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂、促進(jìn)炎癥因子表達(dá)以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，與高血壓、腦卒中、心肌梗死和心肌肥大等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。

G蛋白偶聯(lián)受體75(G-protein-coupled receptor 75, GPR75)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族中視紫紅質(zhì)樣受體，其功能尚不明確，目前被國際基礎(chǔ)和臨床藥理學(xué)委員會列為孤兒受體[3]。最近，Garcia等[4]報道20-HETE通過激活GPR75導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞收縮以及內(nèi)皮功能紊亂，從而誘導(dǎo)CYP4A12轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生20-HETE依賴性高血壓。20-HETE-GPR75受體配對機制在血管系統(tǒng)中的發(fā)現(xiàn)，對研究GPR75的生物學(xué)作用以及20-HETE在心血管疾病中的病理、生理作用具有重要意義。然而，GPR75是否在心臟組織中表達(dá)并介導(dǎo)20-HETE的心肌損傷作用，尚未見相關(guān)報道。本實驗通過體外培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞，觀察GPR75的表達(dá)及其對20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響，為探究20-HETE參與缺血性心肌病的分子機制提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞系 H9c2心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞實驗。

1.2主要試劑 20-HETE購自Sigma；慢病毒包裝試劑盒購自GeneCopoeia；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及JC-1熒光探針購自上海碧云天公司；RT-qPCR引物由上海捷瑞公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光SYBR GreenI購自TaKaRa；Caspase-3活性檢測試劑盒購自索萊寶科技有限公司；兔抗Bax抗體、兔抗Bcl-2抗體及兔抗GPR75抗體購自Abcam；兔抗細(xì)胞色素C(cytochromeC, CytC)抗體購自Cell Signaling Technology；抗β-actin抗體及HRP標(biāo)記的Ⅱ抗購自Proteintech。

2 主要方法

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將2×105個細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別加入慢病毒載體[GPR75 shRNA (shGPR75)和control shRNA (shCtrl)]和完全培養(yǎng)基(MOI=5)，培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染24 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用RT-qPCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞隨機分為6組：對照(control)組、20-HETE(100 nmol/L)組、shCtrl+20-HETE(100 nmol/L)組、shGPR75+20-HETE(100 nmol/L)組、shCtrl組和shGPR75組。各加藥組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實驗。

2.2TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 多聚甲醛固定心肌細(xì)胞，TUNEL反應(yīng)液避光孵育，DAPI顯色，甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察，隨機挑選5個200倍視野，計算平均每100個細(xì)胞中含凋亡細(xì)胞的數(shù)量。

2.3Bcl-2、Bax及GPR75的mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。Bcl-2的上游引物序列為5′-TCAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3′，下游引物序列為5′-GGGGTACGAGTGGGATA-3′； Bax的上游引物序列為5′-GGTCCCGAAGTAGGAAAGG-3′，下游引物序列為5′-GCAAACTGGTGCTCAAGG-3′；GPR75的上游引物序列為5′-GCCACAAGCCTGGTCTACAAA-3′,下游引物序列為5′-GTGCTCTGGTGCCTGCGATAC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3′,下游引物序列為5′-ACACCGACCTTCACCATCT-3′。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 30 s；變性94 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計算Bcl-2、Bax及GPR75 mRNA的相對表達(dá)量。

2.4線粒體膜電位(ΔΨm)檢測 清洗細(xì)胞后,加入JC-1熒光探針避光孵育，清洗多余染料，激光共聚焦顯微鏡下觀察。正常ΔΨm在激發(fā)波長585 nm、發(fā)射波長590 nm下產(chǎn)生紅色熒光；ΔΨm降低時，在激發(fā)波長514 nm、發(fā)射波長529 nm下產(chǎn)生綠色熒光，采用LAS AF Lite 2.6 軟件分析平均紅色熒光強度與平均綠色熒光強度的比值，反應(yīng)細(xì)胞線粒體膜電位變化。

2.5caspase-3活性檢測 收集各組細(xì)胞，Bradford法檢測蛋白濃度。于等量細(xì)胞蛋白提取液中加入反應(yīng)緩沖液和底物共同孵育，酶標(biāo)儀于405 nm波長下測定游離對硝基苯胺(p-nitroaniline,pNA)吸光度(A)反映caspase-3酶活性。

2.6Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞,BCA法檢測蛋白濃度。等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后封閉，分別加入Ⅰ抗(鼠抗β-actin、兔抗CytC、兔抗GPR75、兔抗Bax和兔抗Bcl-2), 4 ℃孵育過夜，再加入Ⅱ抗室溫孵育1 h。ECL法顯影，暗室曝光，ImageJ 1.48軟件分析，以β-actin 作為內(nèi)參照，以靶蛋白與β-actin的比值反應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢病毒shGPR75感染H9c2心肌細(xì)胞后GPR75 mRNA及蛋白的表達(dá)

與control組相比，轉(zhuǎn)染了shGPR75的心肌細(xì)胞GPR75 mRNA及蛋白的表達(dá)分別降低了71.24%和64.95% (P<0.05,)，而轉(zhuǎn)染了shCtrl的心肌細(xì)胞中GPR75 mRNA及蛋白的表達(dá)與control組無顯著差異(P>0.05),見圖1。

Figure 1.The effects of shGPR75 transfection on mRNA and protein expression of GPR75 in H9c2 cells. A: the mRNA expression of GPR75 was detected by RT-qPCR; B: the protein expression levels of GPR75 were detected by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group and shCtrl group.

圖1 轉(zhuǎn)染shGPR75對GPR75 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2 敲減GPR75對20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

與control組相比，使用20-HETE處理后心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05);心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-GPR75，敲減GPR75表達(dá)后，20-HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05);作為陽性對照，采用20-HETE處理轉(zhuǎn)染了shCtrl的心肌細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率亦顯著增加(P<0.05);單獨轉(zhuǎn)染shCtrl和shGPR75組與control組無顯著差異(P>0.05)，見圖2。

3 敲減GPR75對20-HETE誘導(dǎo)的Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

與control組相比，20-HETE處理組心肌細(xì)胞中Bax的mRNA表達(dá)增加，Bcl-2的mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；敲減GPR75后，與20-HETE處理組相比，Bax的mRNA表達(dá)降低，Bcl-2的mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，見圖3A。與mRNA表達(dá)水平的變化一致，20-HETE處理后心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，而敲減GPR75顯著抑制了20-HETE這種作用(P<0.05),單獨轉(zhuǎn)染shCtrl和shGPR75組與control組無顯著差異(P>0.05),見圖3B。

4 敲減GPR75阻斷20-HETE誘發(fā)細(xì)胞線粒體膜電位下降

與control組相比，20-HETE處理組細(xì)胞ΔΨm顯著下降，而敲減GPR75顯著抑制了20-HETE誘導(dǎo)的ΔΨm下降(P<0.05)，20-HETE處理轉(zhuǎn)染了shCtrl的心肌細(xì)胞后ΔΨm亦下降(P<0.05),單獨轉(zhuǎn)染shCtrl和shGPR75組與control組無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

5 敲減GPR75抑制20-HETE誘導(dǎo)的CytC蛋白表達(dá)增高及caspase-3活性增強作用

20-HETE處理H9c2心肌細(xì)胞后，CytC蛋白表達(dá)與control組相比顯著增高(P<0.05)，同時，caspase-3活性顯著增強(P<0.05)；而敲減GPR75顯著阻斷了20-HETE誘導(dǎo)的CytC蛋白表達(dá)增高和caspase-3活性增強作用(P<0.05); 20-HETE處理轉(zhuǎn)染了shCtrl的心肌細(xì)胞后CytC蛋白表達(dá)亦升高(P<0.05)，caspase-3活性亦增強(P<0.05);單獨轉(zhuǎn)染shCtrl和shGPR75組與control組無顯著差異(P>0.05)，見圖5。

Figure 2.The effects of knockdown ofGPR75on 20-HETE-induced cardiomyocyte apoptosis detected by TUNEL staining. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group and shCtrl group;#P<0.05vs20-HETE group and shCtrl+20-HETE group.

圖2 敲減GPR75對20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

討 論

作為近年發(fā)現(xiàn)的心血管活性物質(zhì)，20-HETE發(fā)揮生理、病理作用的受體機制一直受到學(xué)者關(guān)注。最近，有研究者[4-5]通過點擊化學(xué)交聯(lián)和伴侶蛋白分析等方法，在血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中鑒定出GPR75與20-HETE綁定并介導(dǎo)20-HETE依賴性高血壓，提示20-HETE通過與GPR75受體配對機制發(fā)揮生物學(xué)作用。之前曾有學(xué)者報道，大鼠胰島β細(xì)胞中炎癥趨化因子CCL5通過GPR75受體介導(dǎo)促進(jìn)胰島素的分泌[6-7]，但一項基于β-arrestin的G蛋白偶聯(lián)受體檢測實驗未能證實CCL5對GPR75的激活作用[8]。本實驗在大鼠H9c2心肌細(xì)胞中觀察到GPR75在mRNA及蛋白水平均有表達(dá)，且敲減GPR75阻斷了20-HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，提示GPR75與20-HETE在影響心臟功能方面存在密切關(guān)系，為研究20-HETE-GPR75受體配對機制提供了新的實驗證據(jù)。后續(xù)實驗需進(jìn)一步證實20-HETE對心肌細(xì)胞中GPR75表達(dá)及激活的影響，以深入揭示二者作用關(guān)系。

研究顯示在心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)中，心肌組織20-HETE含量增加，抑制其合成可減少再灌注后心肌梗死面積，而外源性加入20-HETE可加重心肌損傷[9]。大量證據(jù)表明細(xì)胞凋亡是MIRI主要特征之一，Wei等[10]證實抑制20-HETE生成可減少大鼠MIRI中細(xì)胞凋亡。我們前期在大鼠離體MIRI中的研究也顯示，20-HETE可通過激活NADPH氧化酶途徑誘導(dǎo)活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成，引起氧化應(yīng)激從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]；在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞中，20-HETE可引起線粒體功能損傷激活內(nèi)源性凋亡途徑從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。與如上研究一致，本實驗中觀察到體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)20-HETE孵育處理后，細(xì)胞凋亡率顯著增加。

Bcl-2蛋白家族在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮重要作用[13]，該蛋白家族主要通過促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2相互作用而發(fā)揮細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[14]，其中Bax蛋白激活將引起線粒體膜電位下降，誘發(fā)線粒體釋放凋亡因子CytC，活化細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。細(xì)胞內(nèi)Bax活化的具體機制尚不清楚，有研究報道細(xì)胞腫瘤抑制基因p53具有直接激活Bax基因以及下調(diào)Bcl-2表達(dá)作用[16]。20-HETE對于Bax蛋白活化機制尚未見報道，但以往研究表明20-HETE具有促進(jìn)心肌細(xì)胞ROS生成作用[17]，而ROS被認(rèn)為是p53介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑的始動因子[18],因此，20-HETE誘導(dǎo)ROS生成引起的氧化應(yīng)激是其激活Bax基因的可能途徑。在本實驗中觀察到，20-HETE具有上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的作用，同時誘發(fā)ΔΨm下降，導(dǎo)致線粒體功能損傷；而敲減GPR75顯著阻斷了20-HETE對于Bax/Bcl-2的調(diào)節(jié)作用，同時也抑制了20-HETE誘導(dǎo)的線粒體ΔΨm下降。線粒體通透性增高、ΔΨm下降可誘發(fā)凋亡相關(guān)因子釋放，其中CytC蛋白的釋放是內(nèi)源性凋亡途徑的關(guān)鍵步驟，一旦釋放則啟動不可逆凋亡[15]。本實驗檢測到20-HETE上調(diào)了CytC蛋白表達(dá)并促進(jìn)caspase-3活性升高，而敲減GPR75后則抑制了20-HETE誘導(dǎo)的促進(jìn)凋亡因子的釋放，進(jìn)一步證實GPR75介導(dǎo)了20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用。

Figure 3.The effects of knockdown ofGPR75on mRNA (A) and protein (B) expression of Bax and Bcl-2 in H9c2 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group and shCtrl group;#P<0.05vs20-HETE group and shCtrl+20-HETE group.

圖3 敲減GPR75對20-HETE誘導(dǎo)的Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

Figure 4.The effects of knockdown ofGPR75on 20-HETE-induced decrease inΔΨmlevel detected by JC-1 staining. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group and shCtrl group;#P<0.05vs20-HETE group and shCtrl+20-HETE group.

圖4 敲減GPR75對20-HETE誘導(dǎo)的ΔΨm水平的影響

Figure 5.The effects of knockdown ofGPR75on 20-HETE-induced CytC expression (A) and caspase-3 activity (B). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group and shCtrl group;#P<0.05vs20-HETE group and shCtrl+20-HETE group.

圖5 敲減GPR75對20-HETE誘導(dǎo)的CytC表達(dá)及caspase-3活性的影響

綜上所述，本實驗觀察到GPR75在大鼠H9c2心肌細(xì)胞中表達(dá)，并通過線粒體損傷機制參與20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，為探索GPR75功能以及20-HETE在缺血性心肌病中的分子、細(xì)胞機制提供了實驗依據(jù)。在心臟中，20-HETE還具有促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成、誘發(fā)鈣超載、導(dǎo)致心肌肥大等心肌損傷作用[17]，這些效應(yīng)是否同樣由GPR75所介導(dǎo)，有待深入研究。