楊 蓉， 趙煥新， 季新燕， 翟曉艷， 楊李旺

(山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030024)

冠狀動脈是給心臟提供血液供應(yīng)的主要?jiǎng)用}，其正常的舒縮功能是保證心肌充足的供血供氧的前提。若冠狀動脈過度收縮，則心肌供血供氧減少，就會誘發(fā)心絞痛、心肌梗死、甚至冠心病猝死等冠狀動脈性疾病(又稱缺血性心臟病)，舒張冠狀動脈對防治心臟缺血性疾病具有重大意義。

血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁組織及維持血管張力的主要細(xì)胞成分，在心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。電壓門控性鉀通道(voltage-gated K+channels，Kv channels)是維持血管平滑肌細(xì)胞正常膜電位和肌張力的重要通道[1-2]。

紅花為傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥,紅花黃色素是從紅花中提取的水溶性活性成分，為紅花的主要藥效成分，屬于黃酮類化合物。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是紅花黃色素結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確的有效單體成分，分子式為C27H32O16，屬小分子查爾酮葡萄糖苷類物質(zhì)。近年來對HSYA舒張血管作用研究頗多，對其舒張機(jī)制也進(jìn)行了初步探討[3-6]，但HSYA對大鼠冠狀動脈(rat coronary artery,RCA)的舒張作用及其與Kv通道的關(guān)系卻未見報(bào)道。

本研究擬采用 DMT 離體血管環(huán)技術(shù)明確HSYA對RCA的肌源性反應(yīng)；采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察HSYA對 RCA平滑肌細(xì)胞Kv電流的影響；采用Western blot技術(shù)探討HSYA對RCA平滑肌細(xì)胞 Kv1.2和 Kv1.5通道蛋白表達(dá)的影響，為HSYA防治心臟缺血性疾病提供藥理學(xué)理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物

正常成年雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重 220～240 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號為SCXK(晉)2017-0001。

2 主要試劑

羥基紅花黃色素 A(Q-008-170303)購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度>98%；U46619、二硫丁四醇、木瓜蛋白酶、白蛋白、膠原蛋白F和膠原蛋白H購自Sigma；兔源Kv1.2和Kv1.5抗體購自Alomone Labs；其余試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)儀器

Multi Myograph System-610離體微血管環(huán)張力記錄儀(DMT)；膜片鉗放大器(Axon)；垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1RCA血管環(huán)的制備 大鼠麻醉后取心臟置于預(yù)冷(4 ℃)、pH 7.4且氧飽和的生理鹽溶液中，分離冠狀動脈，制備冠脈血管環(huán)，將其固定于DMT微血管環(huán)張力記錄儀上。依據(jù)文獻(xiàn)方法[7]，用60 mmol/L KCl收縮RCA，當(dāng)收縮幅度大于2 mN時(shí)，認(rèn)為血管環(huán)反應(yīng)性良好，可用于后續(xù)正式實(shí)驗(yàn)。

4.2HSYA對預(yù)收縮RCA血管環(huán)的舒張作用 向DMT浴槽中分別加入60 mmol/L KCl或0.1 mmol/L U46619，待血管收縮達(dá)坪臺時(shí)，再向浴槽中累積加入3 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L的HSYA，觀察HSYA對預(yù)收縮RCA血管環(huán)的舒張作用。

4.3內(nèi)皮對HSYA舒張U46619 預(yù)收縮RCA血管環(huán)作用的影響 用比冠狀動脈內(nèi)徑稍細(xì)的金屬絲輕輕穿過血管環(huán)，反復(fù)2～3次，機(jī)械性去除冠脈血管內(nèi)皮[8]。依據(jù)文獻(xiàn)方法[9]，用60 mmol/L KCl收縮去內(nèi)皮的RCA血管環(huán)，當(dāng)收縮達(dá)坪臺時(shí)，加入1 μmol/L 乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)舒張血管，若舒張百分比不足60 mmol/L KCl收縮幅度的40%，則認(rèn)為內(nèi)皮去除。在內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組分別加入0.1 mmol/L U46619，待血管收縮達(dá)坪臺時(shí)，再向浴槽中累積加入上述濃度的HSYA，觀察內(nèi)皮對HSYA舒張預(yù)收縮(0.1 mmol/L U46619)冠脈血管環(huán)作用的影響。

4.4HSYA對RCA平滑肌細(xì)胞Kv電流的影響 參照文獻(xiàn)[7]，在37 ℃恒溫且氧飽和條件下，將分離出的RCA放入細(xì)胞酶解液Ⅰ(細(xì)胞分離液中加入0.5 g/L木瓜蛋白酶、1 g/L白蛋白和1 g/L二硫丁四醇)中，孵育20 min，之后將其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞酶解液Ⅱ(細(xì)胞分離液中加入1 g/L白蛋白、0.5 g/L膠原蛋白F和0.5 g/L膠原蛋白H)中，孵育10 min后，用滴管輕輕吹打RCA血管環(huán)，使平滑肌細(xì)胞從血管環(huán)骨架上脫落下來。用連續(xù)電壓刺激(-60 mV～+60 mV，步階10 mV)RCA平滑肌細(xì)胞，以全細(xì)胞膜片鉗方式記錄不同濃度的HSYA對RCA平滑肌細(xì)胞Kv電流的影響，用細(xì)胞的電容標(biāo)化其電流，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用電流密度(pA/pF)表示。

4.5HSYA對RCA平滑肌細(xì)胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表達(dá)的影響 參照文獻(xiàn)[7]將收集的去內(nèi)皮的冠狀動脈分組孵育不同濃度的HSYA，8 h 后取出各組血管環(huán)，液氮速凍后，-80 ℃保存。加RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。等量各組總蛋白經(jīng)SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。根據(jù)目的蛋白的分子量，以Marker為參照，將NC膜裁剪至合適大小后置于Kv1.2 (1∶400)和Kv1.5 (1∶400) I抗中，4 ℃孵育過夜。之后，將NC膜放入辣根酶標(biāo)記的 II 抗中，孵育60 min。目的蛋白以 GAPDH 為內(nèi)參照，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，在Bio-Rad凝膠成像儀中成像并拍照，結(jié)果采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 8 制作統(tǒng)計(jì)圖。

結(jié) 果

1 HSYA對預(yù)收縮RCA血管環(huán)的舒張作用

60 mmol/L KCl和0.1 mmol/L U46619收縮RCA血管環(huán)的幅度分別為(3.57±0.12) mN和(3.76±0.19) mN。10 μmol/L和30 μmol/L HSYA可顯著舒張預(yù)收縮的冠脈血管環(huán)(P<0.05)，使60 mmol/L KCl預(yù)收縮的冠脈血管環(huán)收縮幅度分別降低至(3.27±0.20) mN和(2.94±0.17) mN，使0.1 mmol/L U46619預(yù)收縮的冠脈血管環(huán)收縮幅度分別降低至(3.47±0.16) mN和(3.03±0.17) mN，見圖1。

Figure 1.HSYA-induced vasorelaxation in KCl- and U46619-precontracted RCA rings. Means ±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 HSYA對KCl和 U46619預(yù)收縮大鼠冠脈血管環(huán)的舒張作用

2 內(nèi)皮對HSYA舒張U46619預(yù)收縮RCA血管環(huán)作用的影響

內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組HSYA舒張U46619(0.1 mmol/L)預(yù)收縮RCA血管環(huán)的作用的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0. 05)，見圖2。

Figure 2.HSYA-induced vasorelaxation in endothelium-intact (End+) or -denuded (End-) RCA rings precontracted with U46619. Means±SD.n=6.

圖2 HSYA對U46619 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組RCA血管環(huán)的影響

3 HSYA對RCA平滑肌細(xì)胞Kv電流的影響

在測試電壓為+60 mV 時(shí)，RCA平滑肌細(xì)胞正常Kv電流密度為(43.74±6.09) pA/pF。HSYA可濃度依賴性增加Kv電流密度，3 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L HSYA分別使Kv電流密度增加至(51.26±4.77) pA/pF、(67.81±5.08) pA/pF和(80.67±5.96) pA/pF，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

4 HSYA對RCA平滑肌細(xì)胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表達(dá)的影響

與control組比較，10 μmol/L和30 μmol/L HSYA可使RCA平滑肌細(xì)胞Kv1.2通道蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，增加的百分率分別為(30.91±6.88)%和(39.18±7.11)%；HSYA(10 μmol/L和30 μmol/L)也可使Kv1.5通道蛋白表達(dá)分別顯著增加(28.16±5.87)%和(40.31±6.87)%(P<0.05)，見圖4。

討 論

目前大量研究已肯定了HSYA對心血管系統(tǒng)的藥理作用，HSYA可以抗心肌缺血[10]、抗氧化[11]、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞[12]、舒張大鼠主動脈[6]和豬冠狀動脈[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSYA對KCl和U46619預(yù)收縮的RCA有顯著舒張作用，但其對U46619預(yù)收縮的內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組RCA舒張作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明HSYA舒張RCA的作用與內(nèi)皮無明顯關(guān)系。

Figure 3.The effect of HSYA on Kv currents in freshly isolated RCA smooth muscle cells. A: original recordings of the outward currents evoked by a series of depolarizing pulses (from -60 mV to +60 mV in 10-mV increments for 500 ms duration) in the absence (control) or presence of HSYA (3 μmol/L, 10 μmol/L and 30 μmol/L); B: the current-voltage curves. Means±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 HSYA對RCA平滑肌細(xì)胞Kv電流的影響

Figure 4.The effect of HSYA on the protein expression of Kv1.2 (A) and Kv1.5 (B) in the RCA smooth muscle cells. Means±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖4 HSYA對RCA平滑肌細(xì)胞Kv1.2和Kv1.5蛋白表達(dá)的影響

血管平滑肌細(xì)胞上分布有多種離子通道，鉀離子通道主要包括4種：Kv、鈣依賴性的鉀通道(Ca2+-dependent potassium channel，KCa)、ATP敏感的鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)和內(nèi)向整流鉀通道(inwardly-rectifying potassium channel，KIR)，其中Kv通道在維持細(xì)胞正常膜電位和調(diào)節(jié)冠狀動脈血流方面起著至關(guān)重要的作用[1, 13]。全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSYA可濃度依賴性增加RCA平滑肌細(xì)胞Kv電流，說明經(jīng)由Kv通道促進(jìn)K+外流是HSYA舒張RCA的關(guān)鍵因素。

到目前為止，已經(jīng)明確的Kv通道已有12個(gè)家族、40多種亞型[14]，在動脈平滑肌細(xì)胞上Kv1.2和Kv1.5通道發(fā)揮重要作用[15]。為了進(jìn)一步明確HSYA舒張RCA平滑肌的機(jī)制，及參與此作用的Kv通道亞型，我們采用Western blot法觀察了HSYA對RCA平滑肌上Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSYA可以使RCA平滑肌細(xì)胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表達(dá)顯著增加，從而在分子層面證實(shí)HSYA舒張RCA與Kv通道有關(guān)，同時(shí)提示Kv1.2和Kv1.5通道參與了HSYA對RCA的舒張作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSYA可舒張預(yù)收縮的RCA，該作用與血管內(nèi)皮無關(guān)，其可能的機(jī)制是通過增強(qiáng)Kv通道功能和蛋白表達(dá)而舒張 RCA。本研究結(jié)果為臨床使用HSYA防治心臟缺血性疾病提供理論依據(jù)。