岳繼萍， 王 瑾， 張文婷， 張志楠， 靳文文， 焦向英

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 山西 太原 030001)

《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》指出，未來十年我國(guó)心血管疾病患病人數(shù)仍加速增長(zhǎng)，盡管針對(duì)目前已知原因所采取的治療效果顯著，但心血管病死亡率仍高占居民總死亡原因首位[1]，提示還有一些未知因素參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，人們?cè)谛难茴惣膊∪绺哐獕盒孕呐K病、冠心病和心衰等患者血清中均檢測(cè)到血管緊張素Ⅱ 1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody，AT1-AA)，且其AT1-AA陽性率和滴度都明顯高于正常人[2-4]。有研究表明AT1-AA可以直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[5]，提示 AT1-AA 參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。但是，其誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚。

研究表明自噬(autophagy)與心腦血管等疾病關(guān)系密切。自噬是一種受調(diào)控的程序性死亡，是細(xì)胞內(nèi)降解衰老蛋白、受損胞質(zhì)的過程[6]。生理情況下自噬水平較低；機(jī)體應(yīng)激時(shí)，自噬被激活,為機(jī)體提供能量并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[7-8];而刺激持續(xù)存在時(shí)，過度激活的自噬會(huì)損傷細(xì)胞[9]。AT1-AA具有類血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)的激動(dòng)樣作用，Ang Ⅱ可以激活自噬，那么AT1-AA是否也可激活自噬？是否可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡？

研究表明，氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致細(xì)胞自噬及心功能異常[10-11]，抑制氧化應(yīng)激可以阻止細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。AT1-AA可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[12]，而AT1-AA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與其誘導(dǎo)的自噬、凋亡之間是否有關(guān)有待驗(yàn)證。

材 料 和 方 法

1 材料

H9c2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Cell Max；0.25%胰酶購(gòu)自索萊寶科技有限公司；血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1-R)抑制劑替米沙坦(telmisartan, TM)、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和氧化應(yīng)激抑制劑α-硫辛酸(α-lipoic acid，α-LA)購(gòu)自Sigma；CCK-8檢測(cè)試劑盒、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、凝膠配制試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成公司；LC3抗體、Beclin1抗體、p62抗體、caspase-3抗體和β-actin抗體購(gòu)自CST。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將心肌H9c2細(xì)胞分為陰性對(duì)照(negative IgG)組、AT1-AA處理組、AT1-AA+3-MA處理組、AT1-AA+α-LA處理組和AT1-AA+TM處理組。

2.2AT1-AA的提純 用生物合成的血管緊張素Ⅱ 1型受體胞外第二環(huán)抗原肽段AT1R-ECⅡ(序列為：165～191，IHRNVFFIENTNITVCAFHYESQNSTL)主動(dòng)免疫SD大鼠8周，IgGs親和純化提純AT1-AA，酶標(biāo)儀檢測(cè)其濃度。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞加入96孔板中，細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基吸掉，換加含有不同梯度濃度的AT1-AA培養(yǎng)基分別作用12、24、36和48 h，避光加入10 μL CCK-8液，細(xì)胞孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度(A)值，按照公式[細(xì)胞相對(duì)活力(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)×100%]計(jì)算。

2.4Western blot檢測(cè)蛋白水平 分別檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和p62的表達(dá)以及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平。收集細(xì)胞，加入80 μL RIPA裂解液和1 μL的PMSF吹散細(xì)胞，超聲碎裂1 h，12 000 r/min 離心15 min，取上清。BCA法測(cè)細(xì)胞濃度做SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育 I 抗和 Ⅱ 抗，ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光。曝光條帶用ImageJ軟件做灰度值分析，用β-actin作內(nèi)參照。

2.5氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，碎裂細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min取上清。據(jù)氧化應(yīng)激指標(biāo)GSH-Px、SOD和MDA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)相關(guān)數(shù)據(jù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AT1-AA引起H9c2細(xì)胞活力下降，凋亡增加

與negative IgG組相比，隨著AT1-AA濃度的升高，H9c2細(xì)胞的活力逐漸下降，在10-5mol/L時(shí)下降顯著(P<0.01)，見圖1A；10-5mol/L的AT1-AA分別孵育H9c2細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)(12 h、24 h、36 h和48 h)，與negative IgG相比，AT1-AA處理細(xì)胞24 h～48 h,細(xì)胞活力均顯著下降(P<0.01)，見圖1A。以上結(jié)果提示AT1-AA可濃度和時(shí)間依賴性的降低心肌H9c2細(xì)胞的活力。10-5mol/L的AT1-AA處理H9c2細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平,結(jié)果顯示，與negative IgG組相比，AT1-AA組H9c2細(xì)胞的cleaved caspase-3水平上升(P<0.01)，見圖1B,提示AT1-AA可以誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞凋亡。

Figure 1.The changes of the viability (A) and the expression of cleaved caspase-3 (B) in the H9c2 cells induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsnegative IgG group.

圖1 AT1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的存活率及caspase-3的表達(dá)變化

2 AT1-AA誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞自噬增加

10-5mol/L AT1-AA處理細(xì)胞24 h后，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和p62的蛋白水平，結(jié)果顯示，與negative IgG組相比，AT1-AA組H9c2細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白的水平增加(P<0.01)，而p62蛋白的水平則降低(P<0.01)，見圖2。這提示AT1-AA可以誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞自噬。

3 自噬抑制劑3-MA抑制AT1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡

10-5mol/L的3-MA預(yù)處理細(xì)胞1 h后，再加AT1-AA(10-5mol/L)處理細(xì)胞24 h。用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與AT1-AA組相比，AT1-AA+3-MA組的H9c2細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白的表達(dá)水平下降(P<0.05)，而p62蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見圖3A，提示AT1-AA誘導(dǎo)的自噬被抑制。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平，結(jié)果顯示,與AT1-AA組相比，AT1-AA+3-MA組細(xì)胞的cleaved caspase-3/caspase-3水平下降(P<0.05)，見圖3B。以上結(jié)果提示抑制自噬可抑制AT1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。

4 AT1-AA激活H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激

10-5mol/L的AT1-AA處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞用氧化應(yīng)激試劑盒檢測(cè)GSH-Px、MDA和SOD的水平，發(fā)現(xiàn)AT1-AA組的GSH-Px和SOD高于negative IgG組，MDA低于negative IgG組(P<0.05)，見表1。

5 氧化應(yīng)激抑制劑α-LA降低AT1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的自噬和凋亡水平

10-4mol/L α-LA預(yù)處理H9c2細(xì)胞12 h，再加AT1-AA(10-5mol/L)處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。氧化應(yīng)激試劑盒檢測(cè)GSH-Px、MDA和SOD的水平發(fā)現(xiàn)，與AT1-AA組相比，AT1-AA+α-LA組細(xì)胞的GSH-Px和SOD水平降低，而MDA水平升高(P<0.05),見表1。Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和p62的水平，結(jié)果顯示，與AT1-AA組相比，AT1-AA+α-LA組H9c2細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，而p62蛋白表達(dá)則上升(P<0.05)，見圖4A。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平，結(jié)果顯示,與AT1-AA組相比，AT1-AA+α-LA組細(xì)胞的cleaved caspase-3水平下降(P<0.05)，見圖4B。以上結(jié)果提示氧化應(yīng)激抑制劑α-LA可以抑制AT1-AA誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞的自噬和凋亡。

Figure 2.The autophagy of H9c2 cells was induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsnegative IgG group.

圖2 AT1-AA誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的自噬增加

Figure 3.Autophagy inhibitor 3-MA reduced the protein levels of autophagy (A)- and apoptosis (B)- associated molecules in the H9c2 cells induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsnegative IgG group;#P<0.05vsAT1-AA group.

圖3 自噬抑制劑3-MA抑制AT1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的自噬和凋亡的水平

表1 氧化應(yīng)激水平的變化

Table 1.The levels of GSH-Px, MDA and SOD (Mean±SEM.n=10).

Group GSH-Px(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)SOD(U/mg prot)Negative IgG23.077±8.5710.507±0.20526.973±8.091 AT1-AA110.110±7.253*0.127±0.037*57.499±10.356*AT1-AA+α-LA61.319±9.890#0.261±0.084#44.575±6.556# AT1-AA+TM40.879±7.912#0.285±0.101#34.547±5.622#

*P<0.05vsnegative IgG group;#P<0.05vsAT1-AA group.

6 AT1-R抑制劑TM降低AT1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激、自噬和凋亡水平

10-6mol/L的TM預(yù)處理細(xì)胞1 h，AT1-AA+TM再處理H9c2細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。氧化應(yīng)激試劑盒分別檢測(cè)GSH-Px、MDA和SOD的水平發(fā)現(xiàn)，與AT1-AA組相比，AT1-AA+TM組的GSH-Px和SOD水平降低，而MDA水平升高(P<0.05)，見表1。Western blot檢測(cè)LC3、Beclin1和p62的蛋白水平,結(jié)果顯示與AT1-AA組相比，AT1-AA+TM組H9c2細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，而p62蛋白表達(dá)則增加(P<0.05)，見圖5A。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平，結(jié)果顯示,與AT1-AA組相比，AT1-AA+TM組細(xì)胞的cleaved caspase-3水平下降(P<0.05)，見圖5B。以上結(jié)果提示AT1-R抑制劑TM可以降低AT1-AA誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激、自噬和凋亡水平。

Figure 4.Oxidative stress inhibitor α-LA reduced the protein levels of autophagy (A)- and apoptosis (B)- associated molecules in the H9c2 cells induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsnegative IgG group;#P<0.05vsAT1-AA group.

圖4 氧化應(yīng)激抑制劑α-LA降低AT1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的自噬和凋亡水平

Figure 5.Telmisartan (TM) attenuated the protein levels of autophagy (A)- and apoptosis (B)- associated molecules in the H9c2 cells induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsnegative IgG group;#P<0.05vsAT1-AA group.

圖5 替米沙坦降低AT1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的自噬和凋亡水平

討 論

本研究首先用CCK-8法檢測(cè)了AT1-AA可以濃度及時(shí)間依賴性降低H9c2細(xì)胞的活力；與negative IgG組相比，Western blot法檢測(cè)顯示AT1-AA組凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平上升，提示AT1-AA可以導(dǎo)致心肌H9c2細(xì)胞活力下降,凋亡增加。而AT1-AA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制不清。

自噬是溶酶體降解并清除受損細(xì)胞器的過程。通過平衡細(xì)胞合成和分解，自噬可以穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。然而, 過度自噬可致細(xì)胞發(fā)生Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。自噬的程度可用LC3-Ⅱ/LC3-I比值評(píng)價(jià)，隨著自噬發(fā)生，LC3-Ⅱ蛋白逐漸增加[13]。在自噬溶酶體降解過程中，p62受體作為底物結(jié)合物被降解清除，而當(dāng)自噬受阻，p62蛋白的表達(dá)水平則顯著上調(diào)[14]。Beclin1是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，可以調(diào)節(jié)自噬活性[15]。本研究通過用Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，AT1-AA促進(jìn)LC3-Ⅱ/LC3-I和Beclin1的表達(dá)，而抑制p62蛋白的表達(dá)，表明AT1-AA可以激活自噬；為了進(jìn)一步探討自噬對(duì)AT1-AA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響，我們用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AT1-AA對(duì)細(xì)胞的促凋亡作用被抑制。這說明自噬參與AT1-AA誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞的凋亡過程。

氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞可通過自噬降解受損細(xì)胞器和長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)[16]。研究表明，自噬與氧化應(yīng)激共同參與許多心臟疾病的發(fā)生發(fā)展，探討自噬與氧化應(yīng)激的可能關(guān)系有望成為心臟疾病的治療新靶點(diǎn)[17-18]。研究表明AT1-AA可以激活氧化應(yīng)激[19]，與本研究的結(jié)果一致。而加入氧化應(yīng)激抑制劑α-LA處理H9c2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，AT1-AA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激被抑制，自噬和凋亡水平也有所下降，提示氧化應(yīng)激位于自噬和凋亡的上游且調(diào)控AT1-AA誘導(dǎo)的自噬和凋亡過程。

研究表明，AT1-AA可以通過專一識(shí)別、結(jié)合AT1-R受體來發(fā)揮類血管緊張素Ⅱ的激動(dòng)樣作用且其對(duì)AT1-R的刺激作用不易脫敏[2， 20]。因此為了進(jìn)一步驗(yàn)證AT1-R是否參與了AT1-AA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、自噬和凋亡，我們采用AT1-R抑制劑TM預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果表明AT1-AA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、自噬和凋亡水平明顯降低，提示AT1-AA通過AT1-R影響H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激、自噬和凋亡。

綜上所述，AT1-AA可以通過AT1-R激活氧化應(yīng)激而上調(diào)自噬，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡增加。