鄭文學(xué)， 荊 哲， 郭文昀， 張 濤， 陳 霞， 吳兆琦， 崔恒強(qiáng)， 楊紅寧， 張玉秀， 惠 玲， 陳永清△

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院 1心血管內(nèi)科， 2醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科， 甘肅 蘭州 730000)

糖尿病高血糖可導(dǎo)致心血管系統(tǒng)多種病理性改變，但有關(guān)高血糖對(duì)心肌細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制研究仍然有限。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter, MCU)通過依靠線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, Δψm)高選擇性地?cái)z取Ca2+調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)游離鈣離子濃度(mitochondrial free Ca2+concentration, [Ca2+]m)穩(wěn)態(tài)[1-2]。[Ca2+]m可以作用于線粒體三羧酸循環(huán)中丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)進(jìn)而影響線粒體能量代謝及功能[3-4]，而線粒體功能障礙和線粒體氧化應(yīng)激增強(qiáng)引起心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病發(fā)病的主要病理生理機(jī)制[5-7]。精胺(spermine, Sp)是MCU的激動(dòng)劑，可能通過變構(gòu)激活作用增加MCU對(duì)Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[8-11]，在心肌細(xì)胞中精胺可通過激動(dòng)MCU增加Ca2+向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[12-13]。有研究表明高糖(high glucose,HG)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞[Ca2+]m降低[14-15]，但是關(guān)于高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中MCU表達(dá)變化及[Ca2+]m穩(wěn)態(tài)與心肌細(xì)胞凋亡之間的具體機(jī)制尚不清楚。

本研究采用高糖培養(yǎng)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞模擬糖尿病高糖對(duì)心肌細(xì)胞損傷的病理過程，探討高糖通過降低MCU表達(dá)導(dǎo)致的活性下降促進(jìn)心肌H9c2細(xì)胞凋亡的機(jī)制，以期為糖尿病心肌病的防治研究提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

心肌H9c2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

2 主要試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胰蛋白酶(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；精胺、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白含量測(cè)定試劑、PMSF、Ⅰ抗、ATP檢測(cè)試劑盒、JC-1檢測(cè)試劑盒、活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)試劑盒、β-actin抗體和Ⅱ抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Rhod-2 AM、MCU、caspase-9和caspase-3抗體(Abcam)；PDH活性檢測(cè)試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)；TRIzol、引物合成、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(TaKaRa)。

3 主要方法

3.1細(xì)胞分組 細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照(control)組(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇處理細(xì)胞)、HG組(25 mmol/L 葡萄糖處理細(xì)胞)和HG+Sp組(25 mmol/L葡萄糖+5 μmol/L精胺處理細(xì)胞)。各組細(xì)胞均在處理后于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。

3.2Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá) RIPA裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度并將其調(diào)整一致。各蛋白樣本取20 μg進(jìn)行12%SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用MCU(1∶500)、caspase-9(1∶500)、caspase-3(1∶500)和β-actin(1∶500)Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。洗膜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗(1∶3 000)室溫孵育膜1 h。洗膜后，超敏ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。采用目的蛋白與內(nèi)參照β-actin灰度值的比值反映蛋白的表達(dá)水平。

3.3RT-qPCR 檢測(cè)mRNA表達(dá) TRIzol法提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qPCR。MCU的上游引物序列為5’-GAGACTGAGAGACCCGCTACA-3’，下游引物序列為5’-AAGGCGTGAGTTACAAACAGG-3’；β-actin的上游引物序列為5’-AGCCATGTACGTAGCCATCCA-3’，下游引物序列為5’-TCTCCGGAGTCCATCACAATG-3’。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，轉(zhuǎn)為4 ℃保存。反應(yīng)在Rotor-Gene 300 Real-time PCR儀上進(jìn)行；用Rotor-Gene 6.1 software分析數(shù)據(jù)。

3.4線粒體Ca2+濃度檢測(cè) Rhod-2 AM工作液(2 μmol/L)覆蓋細(xì)胞，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60 min，洗滌后，HBSS 溶液覆蓋細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育約30 min，熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞(激發(fā)波長(zhǎng)545 nm)，熒光強(qiáng)度代表線粒體內(nèi)Ca2+濃度。

3.5PDH活性檢測(cè) 按照PDH活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，每200萬(wàn)細(xì)胞加入400 μL提取液，超聲波破碎細(xì)胞(功率200 W，工作3 s，間歇10 s，工作35次)，12 000×g、 4 ℃離心30 min，取上清。PDH催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶進(jìn)一步催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340 nm有吸收峰，通過測(cè)定340 nm光吸收下降速率，來(lái)計(jì)算PDH活性。

3.6ATP濃度的檢測(cè) 按照ATP檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，6孔板每孔加入200 μL裂解液完全裂解細(xì)胞，12 000×g、4 ℃離心5 min，取上清。當(dāng)螢光素酶和螢光素過量時(shí)，在一定范圍內(nèi)熒光產(chǎn)生和ATP濃度成正比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中ATP濃度。

3.7線粒體膜電位的檢測(cè) 用PBS洗滌6孔板中的細(xì)胞1次，每孔分別加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液和1 mL JC-1染色工作液，充分混勻。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。棄上清，用1×染色緩沖液洗滌2次，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)Δψm較高時(shí)，JC-1熒光探針聚集在線粒體的基質(zhì)中形成聚合物(aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)Δψm處于較低水平時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，JC-1單體(monomers)產(chǎn)生綠色熒光。用紅綠熒光相對(duì)比例的增減來(lái)反映Δψm的變化。

3.8活性氧簇檢測(cè) MitoSOXTM染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體ROS水平。按照1∶1 000用HBSS/ Ca2+/Mg2+稀釋MitoSOXTM，終濃度為5 μmol/L工作液。6孔板1孔中加入500 μL工作液，充分覆蓋細(xì)胞，另一個(gè)孔中加500 μL HBSS/Ca2+/Mg2+作為陰性對(duì)照，37 ℃避光孵育10 min。去除MitoSOXTM工作液，使用溫HBSS/Ca2+/Mg2+輕微清洗3遍。使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，用紅色熒光強(qiáng)度的相對(duì)比例來(lái)反映ROS水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示各組數(shù)據(jù)，兩組之間的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高糖培養(yǎng)的心肌H9c2細(xì)胞中MCU表達(dá)降低

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，HG組和HG+Sp組H9c2細(xì)胞中MCU蛋白表達(dá)降低(P<0.05),見圖1A; RT-qPCR 檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，HG組及HG+Sp組MCU 的mRNA表達(dá)減低(P<0.05)，見圖1B。

2 激活MCU改善高糖誘導(dǎo)的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡和代謝

Rhod-2 AM探針檢測(cè)[Ca2+]m結(jié)果顯示，HG組[Ca2+]m較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；與HG組相比，HG+Sp組[Ca2+]m升高(P<0.05)，見圖2。PDH活性檢測(cè)結(jié)果顯示，HG組H9c2細(xì)胞中PDH的活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；與HG組相比，HG+SP組的H9c2細(xì)胞中PDH活性則顯著升高(P<0.05),見圖3A。ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，HG組H9c2細(xì)胞的ATP濃度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；與HG組的相比，HG+SP組的ATP濃度顯著增加(P<0.05)，見圖3B。

Figure 1.Comparisons of the protein (A) and mRNA (B) expression of MCU among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group.

圖1 各組心肌細(xì)胞中MCU蛋白及mRNA表達(dá)比較

Figure 2.Comparisons of [Ca2+]mamong control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖2 各組H9c2細(xì)胞線粒體中[Ca2+]m的比較

3 激活MCU減低高糖誘導(dǎo)的線粒體功能損傷

JC-1活性檢測(cè)結(jié)果顯示，HG組H9c2細(xì)胞的Δψm顯著低于對(duì)照組，JC-1 monomers/aggregates比值升高(P<0.05)；與HG組相比，HG+Sp組的Δψm則顯著增加,JC-1 monomers/aggregates比值降低(P<0.05)，見圖4。MitoSOXTM染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體的ROS水平，結(jié)果顯示HG組的ROS水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；與HG組相比，HG+Sp組的ROS水平則顯著減低(P<0.05)，見圖5。

4 激活MCU減低高糖誘導(dǎo)的線粒體內(nèi)源性細(xì)胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HG組H9c2細(xì)胞中caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與HG組相比，HG+Sp組的H9c2細(xì)胞中caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)，見圖6。

討 論

目前有關(guān)高血糖引起心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制還未明確。我們采用高糖條件下培養(yǎng)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞模擬糖尿病高糖對(duì)心肌細(xì)胞損傷的病理過程。

Figure 3.Comparisons of pyruvate dehydrogenase (PDH) activity (A) and ATP content (B) among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖3 各組心肌細(xì)胞中PDH活性和ATP濃度比較

Figure 4.Comparisons of mitochondrial membrane potential among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖4 各組H9c2細(xì)胞Δψm水平的比較

Figure 5.Comparisons of mitochondrial ROS levels among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖5 各組H9c2細(xì)胞線粒體ROS水平的比較

Figure 6.Comparisons of caspase-3 and caspase-9 protein levels among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖6 各組H9c2細(xì)胞中caspase-3和caspase-9表達(dá)的比較

線粒體Ca2+攝取主要通過線粒體Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物(mitochondrial Ca2+uniporter complex, MCUC)實(shí)現(xiàn)，蛋白質(zhì)MCU組成該復(fù)合物Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的孔道[1-2]。MCU通過依靠Δψm高選擇性地?cái)z取Ca2+來(lái)調(diào)節(jié)[Ca2+]m穩(wěn)態(tài)[1-2]。我們的研究表明高糖通過MCU表達(dá)降低導(dǎo)致的活性下降使[Ca2+]m減低，這與前期研究結(jié)果一致[16-17]。但是高糖通過MCU表達(dá)降低導(dǎo)致的活性下降使[Ca2+]m降低與高糖促使心肌細(xì)胞凋亡之間的機(jī)制還不清楚。

我們的研究結(jié)果顯示MCU表達(dá)降低導(dǎo)致的活性下降，促使線粒體PDH活性、細(xì)胞ATP濃度和Δψm降低，而線粒體ROS水平升高。精胺沒有影響MCU蛋白和基因的表達(dá)，精胺可能通過變構(gòu)激活作用增加MCU對(duì)Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[8-11]。同樣，心肌細(xì)胞中精胺可激動(dòng)MCU增加線粒體[Ca2+]m[12-13]。[Ca2+]m可以激活線粒體基質(zhì)中的幾種三羧酸循環(huán)中脫氫酶(包括PDH)，從而調(diào)節(jié)線粒體能量代謝及功能[3-4]。線粒體功能障礙和線粒體氧化應(yīng)激增強(qiáng)引起心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病發(fā)病的主要病理機(jī)制[5-7]。在高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中加入精胺后，我們觀察到線粒體[Ca2+]m、線粒體PDH活性、細(xì)胞ATP濃度和Δψm都顯著升高，而ROS水平降低，caspase-9和caspase-3凋亡蛋白表達(dá)減少。因此，我們的研究結(jié)果表明在高糖培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中恢復(fù)線粒體[Ca2+]m對(duì)依賴Ca2+的線粒體功能產(chǎn)生正向影響。恢復(fù)高糖培養(yǎng)的的H9c2細(xì)胞中[Ca2+]m穩(wěn)態(tài)使線粒體PDH活性增加，細(xì)胞ATP濃度增加，線粒體膜電位升高，而ROS水平降低，可能是我們觀察到H9c2細(xì)胞凋亡減少的原因。

綜上所述，高糖通過降低MCU表達(dá)導(dǎo)致其活性下降可促進(jìn)心肌H9c2細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與線粒體的鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、三羧酸循環(huán)障礙和線粒體功能損傷有關(guān)。