王巖 楊龍艷 孫榮欣 張媛媛 付穎 趙冬

[摘要] 目的 探討ERBB3在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能和作用。 方法 收集2017年12月～2018年12月北京潞河醫(yī)院內(nèi)分泌科甲狀腺癌患者4例與甲狀腺結(jié)節(jié)患者6例的細針穿刺組織進行RNA-seq檢測，并分析ERBB3水平;利用TCGA甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫與GEO甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫，分析比較癌與癌旁，T、N分期，復發(fā)患者中ERBB3的水平;采用基因富集分析GSEA分析ERBB3水平與EGFR、PI3K、ERK1/2信號通路的關(guān)系，以及腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 結(jié)果 與良性甲狀腺結(jié)節(jié)比較，ERBB3 mRNA在甲狀腺癌中表達量升高（P < 0.001）。與癌旁比較，ERBB3 mRNA在甲狀腺癌組織中升高（TCGA來源：P < 0.0001;GEO來源：P < 0.0001）。在甲狀腺癌患者中，EGFR、PI3K、ERK1/2基因集顯著富集于ERBB3高表達患者中。隨著T分期的增長，ERBB3水平逐漸增加（P < 0.0001）;與增殖相關(guān)的基因集顯著富集于ERBB3高表達患者中。與N0組比較，N1期患者ERBB3水平顯著增加（P < 0.0001）。與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因集顯著富集于ERBB3高表達患者中。甲狀腺癌復發(fā)患者ERBB3的水平升高（P = 0.0124）。 結(jié)論 ERBB3可能參與了甲狀腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移及復發(fā)，有望成為甲狀腺癌治療的新靶點。

[關(guān)鍵詞] ERBB3;甲狀腺癌;增殖;轉(zhuǎn)移;復發(fā)

[中圖分類號] R73? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）02（b）-0018-05

ERBB3 expression in thyroid cancer and its significance

WANG Yan*? ?YANG Longyan*? ?SUN Rongxin? ?ZHANG Yuanyuan? ?FU Ying? ?ZHAO Dong▲

Endocrine Metabolism and Immunization Center， Luhe Hospital， Capital Medical University， Beijing? ?101149， China

[Objective] To investigate the effect and function of ERBB3 in the occurrence and development of thyroid cancer at clinical level. Methods The fine needle puncture tissues of 4 patients with thyroid cancer and 6 patients with thyroid nodule in Department of Endocrinology， Beijing Luhe Hospital from December 2017 to December 2018 were collected， RNA-seq was detected and ERBB3 levels were analyzed. The thyroid cancer database of TCGA and the thyroid cancer database of GEO were used to analyze and compare the levels of ERBB3 in patients with recurrent and paracancer， T and N stages. Gene enrichment analysis was used to analyze the relationship between ERBB3 level and EGFR， PI3K and ERK1/2 signaling pathways， as well as the relationship between tumor proliferation and metastasis. Results ERBB3 mRNA was increased in thyroid cancer compared with benign thyroid nodules （P < 0.001）. Compared with paracancer， ERBB3 mRNA was elevated in thyroid cancer tissues （TCGA source， P < 0.0001; GEO source， P < 0.0001）. In thyroid cancer patients， EGFR， PI3K and ERK1/2 gene sets were significantly enriched in patients with high ERBB3 expression. ERBB3 levels increased with the increase of T staging （P < 0.0001）， and the gene sets associated with proliferation were significantly enriched in patients with high ERBB3 expression. Compared with the N0 group， the level of ERBB3 in patients with stage N1 was significantly increased （P < 0.0001）. The gene sets associated with metastasis were significantly enriched in patients with high ERBB3 expression. ERBB3 levels were elevated in patients with recurrent thyroid cancer （P = 0.0124）. Conclusion ERBB3 may be involved in the proliferation， metastasis and recurrence of thyroid cancer and is expected to be a new target for the treatment of thyroid cancer.

[Key words] ERBB3; Thyroid cancer; Proliferation; Metastasis; Recurrence

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來甲狀腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高的趨勢[1]。根據(jù)2013年《中國最新癌癥譜》數(shù)據(jù)，甲狀腺癌的發(fā)病率為6.56/10萬，居女性惡性腫瘤發(fā)病率的第10位。ERBB3又稱為HER3，是表皮生長因子受體（EGFR）家族之一，ERBB3可以與其他受體尤其是ERBB2受體結(jié)合而形成異源二聚體，參與腫瘤細胞信號傳導[2-3]，調(diào)控如胃癌[4-5]、胰腺癌[6-7]、乳腺癌[8-9]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究報道敲減ERBB3抑制甲狀腺癌細胞TPC-1的增殖和單克隆形成[10]。但是目前ERBB3在臨床中關(guān)于甲狀腺癌的作用尚未可知。因此，本研究對6例良性甲狀腺結(jié)節(jié)和4例甲狀腺癌進行了RNA-seq檢測，同時應用甲狀腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫和生物信息學，分析了ERBB3在甲狀腺癌患者中的生物學功能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年12月～2018年12月首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院（以下簡稱“我院”）內(nèi)分泌科收集的甲狀腺結(jié)節(jié)患者6例和甲狀腺癌患者4例。所有患者都經(jīng)過超聲診斷，細針穿刺抽提活檢診斷和病理診斷，甲狀腺結(jié)節(jié)患者與甲狀腺癌患者在年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

表1? ?甲狀腺結(jié)節(jié)患者與甲狀腺癌患者一般資料比較

1.2 數(shù)據(jù)庫來源

甲狀腺癌患者的基因表達譜從TCGA（http：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）網(wǎng)站下載。該數(shù)據(jù)庫中包含501例甲狀腺癌和58例正常甲狀腺的mRNA數(shù)據(jù)。臨床信息從https：//www.synapse.org 和www.cbioportal.org網(wǎng)站下載。

GEO甲狀腺癌 mRNA表達芯片編號GSE3678（包含7例正常甲狀腺正常組織和7例甲狀腺癌組織的數(shù)據(jù)集）來源于GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。

1.3 基因富集分析

采用基因集富集分析（GSEA v3.0，http：//www. broad. mit.edu/gsea/）網(wǎng)站對甲狀腺癌組織標本中信號通路激活情況進行分析[11]。本研究中用的預定義基因集從分子顯著性數(shù)據(jù)庫下載，MSigDB（http：//software.broadinstitute.org/gsea/msigdb），進行了基因富集分析（GSEA v2.0，http：//www.broad.mit.edu/gsea/）。GSEA分別計算通路富集值ES值和錯誤發(fā)生率FDR值，當FDR<0.25時認為在所采用的分組條件下該基因集具有顯著富集。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)（M）或四分位數(shù)（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用Fisher檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ERBB3在甲狀腺癌中的表達量

根據(jù)本研究收集的6例良性甲狀腺結(jié)節(jié)和4例甲狀腺癌患者RNA-seq檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與良性甲狀腺結(jié)節(jié)比較，ERBB3 mRNA水平在甲狀腺癌中顯著升高（P < 0.001）（圖1A）。在甲狀腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，與正常甲狀腺比較，甲狀腺癌中ERBB3 mRNA水平明顯升高（P < 0.00001）（圖1B）。為了進一步明確此結(jié)果，本研究下載了GSE3678數(shù)據(jù)集，分析發(fā)現(xiàn)與甲狀腺癌旁組織比較，ERBB3 mRNA水平在甲狀腺癌組織中顯著升高（P < 0.0001）（圖1C）。

2.2 EGFR、PI3K、ERK1/2基因集在甲狀腺癌中的富集情況

為了檢測甲狀腺癌中ERBB3表達水平與EGFR下游靶基因，及與PI3K/AKT、MAPK/ERK1/2信號通路激活的關(guān)系。將TCGA數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌患者按照ERBB3表達水平的中位數(shù)進行分組，ERBB3表達量大于中位數(shù)即為ERBB3高表達組，ERBB3表達量小于中位數(shù)即為ERBB3低表達組，進一步采用GSEA分析ERBB3水平與EGFR、MAPK/ERK1/2及PI3K/AKT激活下游靶基因的富集情況，結(jié)果如圖2顯示：EGFR及MAPK/ERK1/2，PI3K/AKT下游基因集顯著富集于ERBB3高表達組。

2.3 ERBB3水平與甲狀腺癌的增殖能力的關(guān)系

為了明確ERBB3對甲狀腺癌增殖的影響，在甲狀腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫中根據(jù)患者T分期對ERBB3的水平進行了分析，T分期代表了腫瘤生長增殖的不同程度，發(fā)現(xiàn)隨著T分期的升高，ERBB3水平呈升高的趨勢（P < 0.0001）（圖3A）。為了檢測甲狀腺癌中ERBB3表達水平與細胞增殖之間的相關(guān)性，根據(jù)ERBB3高/低表達針對增殖相關(guān)的基因集進行了基因富集分析，發(fā)現(xiàn)增殖相關(guān)基因集顯著富集于ERBB3高表達組（圖3B）。

2.4 ERBB3水平與甲狀腺癌的遷移和侵襲能力的關(guān)系

在甲狀腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫中根據(jù)患者N分期對ERBB3的水平進行分析，發(fā)現(xiàn)與未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移患者比較，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者中ERBB3的表達顯著升高（P < 0.0001）（圖4A）。為了檢測甲狀腺癌中ERBB3表達水平與淋巴轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，根據(jù)ERBB3高/低表達針對遷移與侵襲相關(guān)的基因集進行了基因富集分析，發(fā)現(xiàn)遷移與侵襲相關(guān)基因集均顯著富集于ERBB3高表達組（圖4B、C、D）。

2.5 甲狀腺癌復發(fā)患者ERBB3的水平升高

研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌復發(fā)明顯增加了甲狀腺癌患者死亡風險，因此本研究分析比較了TCGA數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌復發(fā)患者與未復發(fā)患者中ERBB3的表達水平。與未復發(fā)甲狀腺癌患者比較，復發(fā)甲狀腺癌患者中ERBB3的表達水平顯著升高（P = 0.0124）（圖5）。

3 討論

本研究在臨床樣本水平驗證了ERBB3在甲狀腺癌患者中的作用，利用TCGA甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫通過GSEA發(fā)現(xiàn)ERBB3表達水平與甲狀腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與之前的研究報道，ERBB3敲減抑制甲狀腺癌TPC-1細胞增殖的結(jié)果是一致的。ERBB3屬于ERBB家族的一員，ERBB家族在腫瘤的形成和生長中起到了重要的作用[12-13]。由于ERBB3與家族中其他成員結(jié)構(gòu)不同，不具有激酶活性，不能自行啟動下游信號通路，需要與其他受體結(jié)合，尤其是家族內(nèi)受體[14]，如EGFR、HER2。同時已有研究顯示，ERBB3可以直接啟動PI3K/AKT通路激活，同時可以引起EGFR下游信號通路的活化[15]。因此本研究采用TCGA甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫以ERBB3高低表達分組分析了EGFR基因集的富集情況，發(fā)現(xiàn)EGFR的激活與ERBB3表達量呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ERBB3與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及藥物耐藥性密切相關(guān)[16]，如乳腺癌[17]、前列腺癌[18]、結(jié)直腸癌[19]等，這些癌癥中目前已經(jīng)有針對ERBB3的靶向治療研究或臨床應用。本研究顯示ERBB3有望成為甲狀腺癌靶向治療的一個新靶點，為甲狀腺癌的靶向治療提供了新的理論依據(jù)。

已有研究報道ERBB3蛋白及mRNA在人體內(nèi)的分布基本一致[20]，本研究利用RNA-seq對6例良性甲狀腺結(jié)節(jié)和4例甲狀腺癌的細針穿刺樣品進行檢測，ERBB3 mRNA水平在甲狀腺癌患者組織中明顯升高。TCGA甲狀腺癌數(shù)據(jù)及GEO甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，在甲狀腺癌患者中，癌組織中ERBB3 mRNA表達量較癌旁組織顯著升高。因此無論是結(jié)節(jié)還是癌旁組織，ERBB3在甲狀腺癌組織中特異性升高，這進一步提示甲狀腺癌的發(fā)生與ERBB3的高表達密切相關(guān)，但是其具體的作用機制還需要進一步深入的研究。甲狀腺癌篩選的主要方法是細針穿刺抽吸活檢（FNAB）[21]，但其預測結(jié)果假陰性率高達1%～12%[22]，本研究結(jié)果也為甲狀腺癌的診斷和篩選提供了一定的理論依據(jù)，但是由于本研究細針穿刺樣本量較小，缺乏一定的代表性，所得結(jié)果仍需大樣本的研究來驗證。

本研究在臨床水平發(fā)現(xiàn)ERBB3與甲狀腺癌增殖、轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)，并且其表達水平與甲狀腺癌患者的預后相關(guān)，為以ERBB3為靶點的甲狀腺癌治療提供了新的理論依據(jù)。

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