王穎 周紅群 殷梅 繆薇 朱榆紅

[摘要] 目的 探討依達(dá)拉奉（Eda）與缺血后處理（IP）聯(lián)合使用后對腦缺血再灌注損傷（I/R）的影響，并與單獨(dú)應(yīng)用IP比較，評(píng)價(jià)Eda聯(lián)合IP是否能對I/R產(chǎn)生疊加保護(hù)作用。 方法 選擇SD大鼠36只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對照組（I/R組）、IP組、IP+Eda組，每組12只。I/R組采用線栓法建立大鼠I/R模型，IP組采用線栓法建立大鼠I/R模型的同時(shí)給予IP干預(yù)，IP+Eda組采用線栓法建立大鼠I/R模型的同時(shí)給予Eda和IP干預(yù)。術(shù)后48 h對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積測定;采用熒光定量PCR、Western blot、免疫組化法檢測大鼠腦組織中血管緊張素Ⅱ1型和2型受體（AT1、AT2）的表達(dá);檢測各組大鼠超氧化物歧化酶（SOD）抑制率。 結(jié)果 與I/R組比較，IP+Eda組和IP組神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，大鼠腦梗死體積縮小，AT1、AT2的mRNA和蛋白相對表達(dá)量降低，AT1、AT2陽性細(xì)胞數(shù)減少，SOD抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。IP+Eda組與IP組比較，上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 IP+Eda組能對大鼠I/R產(chǎn)生保護(hù)作用，但兩者聯(lián)合后并不會(huì)產(chǎn)生疊加的保護(hù)效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血/再灌注損傷;依達(dá)拉奉;缺血后處理;血管緊張素Ⅱ1型受體;血管緊張素Ⅱ2型受體

[中圖分類號(hào)] R54? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）02（b）-0013-05

Effect of Edaravone combined with ischemic postconditioning on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

WANG Ying? ?ZHOU Hongqun? ?YIN Mei? ?MIAO Wei? ?ZHU Yuhong

Department of Neurology， the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming? ?650031， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Edaravone （Eda） combined with ischemic postconditioning （IP） on cerebral ischemia-reperfusion injury （I/R）， and to evaluate whether Eda combined with IP have superimpose protective effects on I/R compared with IP alone. Methods Thirty-six SD rats were selected and divided into the control group （I/R group）， IP group and IP+Eda group according to the random number table method， with 12 rats in each group. The rat I/R model was established in the I/R group by suture method. The rat I/R model was established by suture method in the IP group with IP intervention. The rat I/R model was established by suture method in the IP+Eda group with Eda and IP intervention. At 48 h after the operation， the rats were evaluated for neurological deficits and the volume of cerebral infarction was measured. By fluorescence quantitative PCR， Western blot and immunohistochemical method the expression of tissue angiotensin Ⅱ with type 1 and type 2 receptor （AT1， AT2） in the rat brain tissue was detected. The inhibition rate of superoxide dismutase （SOD） of rats in each group was detected. Results Compared with I/R group， IP+Eda group and IP group showed a decrease in neurological deficit score， a decrease in cerebral infarction volume， a decrease in mRNA and protein expression of AT1 and AT2， a decrease in the number of AT1 and AT2 positive cells， and an increase in SOD inhibition rate， with statistically significant differences （P < 0.01 or P < 0.05）. There was no significant difference in the above indicators between the IP+Eda group and the IP group （P > 0.05）. Conclusion The IP+Eda group can protect rat I/R， but the combination of the two groups does not produce a superimposed protective effect.

[Key words] Cerebral ischemia-reperfusion injury; Edaravone; Ischemic postconditioning; Angiotensin Ⅱ type 1 receptor; Angiotensin Ⅱ type 2 receptor

腦缺血/再灌注損傷是一個(gè)包括興奮性氨基酸毒性、自由基及脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙、鈣離子超載、炎癥、細(xì)胞凋亡等在內(nèi)的多環(huán)節(jié)病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1-3]。缺血后處理，即組織器官缺血后，在較長時(shí)間的再灌注之前進(jìn)行反復(fù)、短暫的再灌注/缺血處理，使長期缺血的組織器官在恢復(fù)血流后即刻被充血這一過程受到干擾，進(jìn)而有效調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制以減輕腦缺血再灌注損傷的一種處理措施[4-6]。然而，已有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，一旦腦缺血再灌注損傷的級(jí)聯(lián)損傷反應(yīng)啟動(dòng)，缺血后處理的腦保護(hù)作用一方面無法同時(shí)對抗諸多的病理因素，另一方面還會(huì)使自身的神經(jīng)保護(hù)作用受到限制。基于此，本研究考慮在缺血后處理的基礎(chǔ)上，聯(lián)合一種外源性神經(jīng)保護(hù)制劑，以求達(dá)到更好的腦保護(hù)效應(yīng)。依達(dá)拉奉是臨床常用的一種自由基清除劑，通過靜脈給藥可以快速到達(dá)腦和脊髓內(nèi)，清除具有細(xì)胞毒性的自由基團(tuán)，是一種外源性保護(hù)機(jī)制，具有良好的腦保護(hù)作用[8-11]。本研究旨在聯(lián)合依達(dá)拉奉和缺血后處理兩種內(nèi)、外源性保護(hù)措施，共同對抗腦缺血再灌注損傷，觀察及評(píng)價(jià)兩者聯(lián)合后能不能協(xié)同作用，較單獨(dú)使用缺血后處理發(fā)揮更有效的神經(jīng)保護(hù)作用并探討其相關(guān)機(jī)制，為臨床聯(lián)合使用神經(jīng)保護(hù)方法對抗腦缺血再灌注損傷提供必要的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康雄性SD大鼠36只，SPF級(jí)，質(zhì)量260～280 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[合格證號(hào)：SYXK（京）2017-0033]。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（I/R組）、缺血后處理組（IP組）、依達(dá)拉奉聯(lián)合缺血后處理組（Eda+IP組），每組12只大鼠。本研究通過昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理方法

1.2.1 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型的建立? 給大鼠氣管插管，呼吸機(jī)（瑞沃德）輔助呼吸，1%～2%恩氟烷混合70%N2O及30%O2吸入麻醉。從頸外動(dòng)脈將直徑0.26 mm線栓插入18～20 mm，至大鼠大腦中動(dòng)脈起始處。2 h后拔出線栓，實(shí)現(xiàn)再灌注。48 h后按照Belayev的12評(píng)分法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分[12]。

1.2.2 缺血后處理? IP組和IP+Eda組大鼠在拔除線栓后，即刻用微型動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷血流10 s，開放動(dòng)脈夾恢復(fù)血流10 s，即為1次缺血后處理操作。之后采用相同方式，一共進(jìn)行5個(gè)循環(huán)缺血后處理操作。

1.2.3 缺血后處理后的給藥? IP+Eda組大鼠于缺血后處理后即刻、12 h、24 h分3次按5 mg/kg經(jīng)腹腔注射依達(dá)拉奉（吉林省博大制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：02-1800082）。其他組大鼠于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔內(nèi)注射1 mL 0.9%生理鹽水。

1.3 腦梗死體積的測量

大鼠于再灌注48 h后，將鼠腦置于腦切片模具中切片，后置于2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液中10 min，用Image-Pro Analysis Software 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗死體積。

1.4 熒光定量PCR分析

大鼠再灌注48 h后取出梗死區(qū)腦組織，加入1 mL Trizol提取總RNA。依據(jù)Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，K1621）操作說明合成cDNA，在聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)大鼠血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1）和血管緊張素Ⅱ2型受體（AT2）目的基因的mRNA序列，應(yīng)用beacon designer 7.90設(shè)計(jì)Q-PCR引物，引物序列為，AT1 上引物：5′-AATGACAATCACCACCAA-3′下引物：3′-GCAGG-CACAGTTACATAT-5′;AT2 上引物：5′-AATGATG-AATGCCAACAC-3′，下引物：3′-TCTGCTGAAGACC-AATAG-5′;β-actin上引物：5′-GTGTTGGCATAGAGGTCTT-3′下引物：3′-TATGGAATCCTGTGGCATC-5′。擴(kuò)增條件如下：95℃ 10 min，然后以95℃ 15 s、60℃ 60 s為1個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。最后依據(jù)Maxima？誖RSYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2X）試劑盒（Kapa，KK4601）操作說明進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.5 Western blot檢測

大鼠再灌注48 h后取梗死區(qū)腦組織，將其剪碎并在冰上充分研磨，加入RIPA裂解液冰浴30 min，離心半徑8 cm，4℃，以12 000 r/min離心5 min，取上清液，按常規(guī)方法依次進(jìn)行蛋白濃度測定、電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，封閉，加入1∶800 AT1（Abcam，ab18801），1∶1000 AT2（Abcam，ab92445），1∶1000 β-actin（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TA-09）4℃孵育過夜。第2天加入二抗室溫孵育1 h后顯影，Bio-Rad膜成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測

大鼠再灌注48 h后，4%多聚甲醛[溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS），pH=7.4]灌注大鼠后取腦，固定于4%多聚甲醛PBS溶液48 h。隨后用石蠟包埋、切片，SP法進(jìn)行免疫組化染色。AT1和AT2一抗?jié)舛染鶠?∶200，陰性對照用PBS代替。AT1和AT2陽性細(xì)胞呈棕褐色。在大鼠缺血側(cè)大腦半球梗死灶周圍，光鏡下（20×）選取連續(xù)3個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.7 超氧化物歧化酶（SOD）抑制率檢測

大鼠再灌注48 h后取梗死區(qū)腦組織，按組織重量以1∶9比例加入9倍生理鹽水，剪碎組織，冰浴勻漿，離心半徑8 cm，以3000 r/min離心10 min，取上清液，測定蛋白濃度。按SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，A001-3）檢測并計(jì)算樣本SOD的抑制率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若滿足正態(tài)性分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦梗死體積比較

IP+Eda組及IP組大鼠腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較I/R組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。IP+Eda組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能缺血評(píng)分與IP組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2各組大鼠AT1和AT2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較

IP+Eda組與IP組大鼠AT1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量及AT2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均較I/R組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。IP+Eda組AT1及AT2 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量與IP相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2～3。

A：各實(shí)驗(yàn)組AT1蛋白和β-actin條帶;B：各實(shí)驗(yàn)組AT1 mRNA相對表達(dá)量;C：各實(shí)驗(yàn)組AT1蛋白相對表達(dá)量。*P < 0.05，**P < 0.01。AT1：血管緊張素Ⅱ1型受體

2.3 各組大鼠AT1和AT2陽性細(xì)胞比較

各組大鼠缺血側(cè)腦組織均可見AT1、AT2陽性細(xì)胞，主要分布在梗死灶周圍。IP+Eda組與IP組的AT1、AT2陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。IP+Eda組AT1、AT2陽性細(xì)胞數(shù)與IP組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4、圖5（封四），圖6。

2.4 各組大鼠SOD抑制率的比較

IP+Eda組與IP組SOD抑制率明顯高于I/R組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。IP+Eda組SOD抑制率與IP組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖6。

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS），也被稱為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS），分布于腎臟、腎上腺、心臟、脈管系統(tǒng)，在體內(nèi)是一種重要的激素及體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可產(chǎn)生強(qiáng)烈的縮血管效應(yīng)及促血管增生作用，負(fù)責(zé)血壓、體液和電解質(zhì)平衡以及全身血管阻力的調(diào)節(jié)[13]。自從Detlev Ganten證實(shí)腦內(nèi)也存在獨(dú)立的RAS后，RAS與神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系便成為研究熱點(diǎn)之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RAS在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的效應(yīng)[14]。李蓓華等[15]發(fā)現(xiàn)在血管性癡呆大鼠的血漿和腦組織中，腎素活性及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ的水平有明顯的升高，證實(shí)RAS在腦血管病的發(fā)生過程中有重要的作用。Gebre等[16]證實(shí)針對目標(biāo)性的RAS給予血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑干預(yù)后，可減少腦內(nèi)淀粉樣斑塊的沉積，使阿爾茨海默癥患者從中受益。

在RAS中，腎素將血管緊張素原分解，產(chǎn)生無活性的血管緊張素Ⅰ，隨后在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的作用下轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ。血管緊張素Ⅱ是一種血管活性物質(zhì)，主要有兩種G蛋白偶聯(lián)受體，分別是AT1和AT2。在腦缺血事件發(fā)生后，AT1受體和AT2受體與血管緊張素Ⅱ結(jié)合，一方面過度收縮血管，干擾顱內(nèi)血管循環(huán)的代償功能;另一方面，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)[17-19]。氧化應(yīng)激反應(yīng)是腦缺血/再灌注損傷過程中一種明確的病理機(jī)制，在這個(gè)過種中超氧陰離子（O2-）的大量生成是其基本特征。血管緊張素Ⅱ與其受體結(jié)合后，通過增加脈管系統(tǒng)中O2-陰離子的水平加速內(nèi)皮功能障礙;同時(shí)還有效活化還原型輔酶Ⅱ氧化酶，促進(jìn)腦細(xì)胞中的線粒體活性氧的生成，加重腦缺血再灌注損傷[20]。Wang等[21]報(bào)道缺血后處理可通過調(diào)節(jié)AT1的表達(dá)來減輕心肌梗死后冠狀動(dòng)脈和間質(zhì)的纖維化。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可通過減少AT1和AT2的表達(dá)來緩解心臟功能障礙。而本研究中也顯示了依達(dá)拉奉聯(lián)合缺血后處理可明顯減輕腦缺血/再灌注損傷，表現(xiàn)為大鼠腦缺血/再灌注損傷后腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損評(píng)分的下降，AT1和AT2表達(dá)的減低及SOD抑制率的上升。

但遺憾的是，依達(dá)拉奉聯(lián)合缺血后處理并沒有表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)保護(hù)協(xié)同作用，兩者聯(lián)合后的神經(jīng)保護(hù)作用與單獨(dú)應(yīng)用缺血后處理相似。可能的原因?yàn)槟X缺血/再灌注損傷后的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)涉及到一系列的機(jī)制，而氧化應(yīng)激反應(yīng)僅是“冰山一角”，依達(dá)拉奉聯(lián)合缺血后處理可能無法同時(shí)對抗包括炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、線粒體損傷在內(nèi)的病理機(jī)制，但究竟是其中的哪一種病理機(jī)制影響了聯(lián)合保護(hù)效應(yīng)，還需要在未來的研究中繼續(xù)探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Wu MY，Yiang GT，Liao WT，et al. The Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury [J]. Cell Physiol Biochem，2018，46（4）：1650-1667.

[2]? 黃麗，朱彩霞，張芹欣，等.四種開竅藥對急性不完全性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦保護(hù)作用[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2018，28（8）：77-82.

[3]? 曾兆祿，韓繼超，薛云，等.針刺結(jié)合丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2016，26（2）：62-66.

[4]? Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK. Interrupting reperfusion as a stroke therapy：ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats [J]. J Cereb Blood Flow Metab，2006，26：1114-1121.

[5]? 徐波.HO-1在缺血后處理抗肺缺血再灌注損傷中的作用及其對STAT-3表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013，21（4）：81-85.

[6]? 王榮亮，趙海蘋，羅玫.遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)對大鼠腦缺血再灌注損傷后MIP-1α表達(dá)的影響[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（8）：24-29，后插1.

[7]? Wang Y，Ge P，Yang L，et al. Protection of ischemic post conditioning against transient focal ischemia-induced brain damage is associated with inhibition of neuroinflammation via modulation of TLR2 and TLR4 pathways [J]. J Neuroinflammation，2014，11：15.

[8]? Sun MS， Jin H，Sun X，et al. Free Radical Damage in Ischemia-Reperfusion Injury：An Obstacle in Acute Ischemic Stroke after Revascularization Therapy [J]. Oxid Med Cell Longev，2018：3804979.

[9]? Dringen R. Metaolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol，2000，62（6）：649-671.

[10]? 韓遵華，段淼，李清香.依達(dá)拉奉對缺氧缺血性腦病新生大鼠腦水腫及CD163/HO-1信號(hào)通路的影響[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2019，29（4）：34-40.

[11]? 米艷，高小平，朱清風(fēng)，等.依達(dá)拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2019，16（13）：16-19.

[12]? Belayev L，Alonso OF，Busto R，et al. Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture [J]. Stroke，1996，27（9）：1616-1622.

[13]? Yang T，Xu C. Physiology and Pathophysiology of the Intrarenal Renin-Angiotensin System： An Update [J]. J Am Soc Nephrol，2017，28（4）：1040-1049.

[14]? Tao MX，Xue X，Gao L，et al. Involvement of angiotensin-（1-7） in the neuroprotection of captopril against focal cerebral ischemia [J]. Neurosci Lett，2018，687：16-21.

[15]? 李蓓華，魯國洲，黃新武.血管性癡呆大鼠腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化[J].中國老年學(xué)雜志，2017， 37（14）：3423-3425.

[16]? Gebre AK，Altaye BM，Atey TM，et al. Targeting Renin-Angiotensin System Against Alzheimer′s Disease [J]. Front Pharmacol，2018，9：440.

[17]? Tang M，Zhao L，Chen Y，et al. Angiotensin Ⅱ protects cortical neurons against oxygen-glucose deprivation-induced injury in vitro [J]. Biomed Rep，2014，2（1）：112-116.

[18]? Wu CY，Zha H，Xia QQ，et al. Expression of angiotensin Ⅱ and its receptors in activated microglia in experimentally induced cerebral ischemia in the adult rats [J]. Mol Cell Biochem，2013，382（1/2）：47-58.

[19]? Alhusban A，Kozak A，Eldashan W，et al. Artery reopening is required for the neurorestorative effects of angiotensin modulation after experimental stroke [J]. Exp Transl Stroke Med，2016，8：4.

[20]? Rodríguez-Lara SQ，García-Benavides L，Miranda-Díaz AG. The Renin-Angiotensin-Aldosterone System as a Therapeutic Target in Late Injury Caused by Ischemia-Reperfusion [J]. Int J Endocrinol，2018，2018：3614303.

[21]? Wang ZF，Wang NP，Harmouche S，et al. Postconditioning attenuates coronary perivascular and interstitial fibrosis through modulating angiotensin Ⅱ receptors and angiotensin-converting enzyme 2 after myocardial infarction [J]. J Surg Res，2017，211：178-190.

[22]? Zhang WW，Bai F，Wang J，et al. Edaravone inhibits pressure overload-induced cardiac fibrosis and dysfunction by reducing expression of angiotensin II AT1 receptor [J]. Drug Des Devel Ther，2017，11：3019-3033.

（收稿日期：2019-10-09? 本文編輯：顧家毓）