隨著我國居民生活水平的提高及人口老齡化加劇，高脂血癥的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。高血脂是誘發(fā)心腦血管疾病的主要危險因素，同時可以引起高血壓、高血糖、肝功能損傷等疾病[1]。目前，臨床上治療高脂血癥的藥物主要為他汀類藥物，這類藥物主要通過抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性實現(xiàn)降血脂的作用[2]。HMG-CoA還原酶主要催化細胞膽固醇合成過程中的限速反應，是膽固醇合成最重要的酶之一。由于斑馬魚的組織器官與人類的器官在結構、生理、分子水平等方面高度相似，加之斑馬魚基因組與人類的基因組高度保守，斑馬魚已經(jīng)被作為多種人類疾病模型廣泛用于藥物篩選[3-4]。燈銀腦通膠囊是治療心腦血管疾病的藥物，在前期1項燈銀腦通膠囊用于治療血管性認知功能障礙的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，病人服用燈銀腦通膠囊后總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白等指標均有不同程度的降低[5]。因此，為了深入研究燈銀腦通膠囊降血脂的作用及機制，本研究采用斑馬魚高血脂模型來評價燈銀腦通膠囊的降血脂作用，并通過相應的體外酶促反應平臺探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 燈銀腦通膠囊(規(guī)格：每粒0.26 g粉末，藥用成分0.098～0.100 g，批號：16FL，昆藥集團股份有限公司)，臨用時膠囊內(nèi)粉末用二甲基亞砜(DMSO)配制成100 mg/mL母液備用；洛伐他汀原料藥(大連美侖生物技術有限公司，批號：20111002)；蛋黃粉(北京天元，批號：20120612)；油紅O(批號：20120411)、DMSO(批號：BCBH5215V)均購自美國Sigma公司；HMG-CoA還原酶抑制劑篩選試劑盒(美國Biovision公司，批號：2I150588)。

1.2 儀器 解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，日本)；與顯微鏡相連的相機(TK-C1481EC，JVC，日本)；精密電子天平(CP214，OHAUS，美國)；全波長酶標儀(SynergyM.HT，BioTek，美國)。

1.3 實驗動物 5 dpf黑色素等位基因突變型半透明Albino系斑馬魚，由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司提供，實驗動物使用許可證號為：SYXK(浙)2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國際實驗動物評估和認可委員會(AAALAC)認證的要求。

1.4 方法

1.4.1 藥物最大耐受濃度測定 斑馬魚幼魚于六孔板中培養(yǎng)至5 dpf后，用燈銀腦通膠囊以水溶給樣方式處理，濃度分別為10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL和500 μg/mL，同時以養(yǎng)魚用水處理正常斑馬魚為正常對照組，在28 ℃培養(yǎng)箱中處理72 h。統(tǒng)計各組斑馬魚的死亡數(shù)量與毒性情況，確定燈銀腦通膠囊的最大耐受濃度。

1.4.2 模型構建與干預方法 用蛋黃粉喂飼Albino品系5 dpf斑馬魚72 h，誘發(fā)斑馬魚高血脂模型[6]，油紅O染色觀察血液染色強度來判斷造模是否成功；成模后用不同濃度的燈銀腦通膠囊處理72 h，每個濃度處理30尾。陽性對照組給予洛伐他汀0.081 μg/mL，同時設置模型對照組。

1.5 觀察指標 比較各組降血脂作用、HMG-CoA還原酶活性

1.5.1 降血脂作用 處理結束后，用油紅O進行染色，染色后每個實驗(濃度)組隨機選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，計算斑馬魚尾部血管血脂光密度總和(S)，燈銀腦通膠囊血脂降低率計算公式：

1.5.2 HMG-CoA還原酶活性 體內(nèi)膽固醇合成限速反應式為：

在這個反應過程中，NADPH被氧化成為NADP+，NADPH在紫外線(UV)波長340 nm下有吸收峰，但是其氧化產(chǎn)物NADP+在此波長下卻沒有吸收峰，因此通過定量加入底物NADPH，檢測反應前后反應體系在340 nm的OD值變化來判斷NADPH的消耗量。在反應體系中加入待篩選藥物，若藥物對HMG-CoA還原酶具有抑制作用，則340 nm吸收值不會下降，藥物對HMG-CoA還原酶的抑制作用越強，HMG-CoA還原酶酶解底物的速率越慢，OD值下降得越緩慢，根據(jù)藥物測定孔、標準加酶孔在酶促反應線性范圍內(nèi)兩個時間點OD值的差異(-△A340 nm)，換算其抑制率。抑制率計算公式為：

本研究中選擇的燈銀腦通膠囊反應濃度分別為100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL，陽性對照為0.116 μg/mL的洛伐他汀，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用方差分析(軟件GraphPad Prism 5)、Dunnett′st檢驗、Fisher LSD分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 藥物最大耐受濃度測定 燈銀腦通膠囊在250 μg/mL和500 μg/mL濃度時，死亡率均為100%，在10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL濃度時，均不誘發(fā)斑馬魚死亡和明顯毒性表型。因此，確定斑馬魚對燈銀腦通膠囊的最大耐受濃度為100 μg/mL。詳見表1。

表1不同濃度燈銀腦通對斑馬魚的致死率

組別劑量(μg/mL)尾數(shù)死亡[尾(%)]正常對照組-300(0.0)燈銀腦通組10 300(0.0)25300(0.0)50300(0.0)100300(0.0)2503030(100.0)500 3030(100.0)

2.2 斑馬魚高脂模型建立結果 用蛋黃粉飼喂斑馬魚，使其血液中的脂肪含量迅速升高，油紅O染色后脂肪呈紅色，從而建立斑馬魚高血脂模型，油紅O染色結果詳見圖1。

圖1 油紅O染色結果

2.3 燈銀腦通膠囊對斑馬魚的降血脂效果 通過對燈銀腦通膠囊1.875～33.300 μg/mL 5個濃度的降血脂效果比較，在3.750～11.100 μg/mL濃度范圍內(nèi)斑馬魚血脂水平顯著降低(P<0.05)，且在7.500 μg/mL時降血脂效果最高，血脂降低率達44%。而隨著燈銀腦通膠囊濃度增加至33.300 μg/mL時，斑馬魚血脂降低率反而下降，因此提示燈銀腦通膠囊在3.750～11.100 μg/mL濃度條件下對蛋黃粉誘發(fā)的斑馬魚高血脂模型具有降血脂作用。詳見圖2、表2。

圖2 燈銀腦通處理后尾部血管染色結果

組別尾數(shù)劑量(μg/mL)尾部血脂光密度總和血脂降低率(%)模型對照組10-833±55-陽性對照組100.081 258±19①69①燈銀腦通組101.875723±73133.750519±55①38①7.500470±63①44①11.100577±75①31①33.300 805±663

與模型對照組比較，① P＜0.05。

2.4 燈銀腦通膠囊對HMG-CoA還原酶活性的影響 燈銀腦通濃度在200 μg/mL、400 μg/mL時對HMG-CoA還原酶的活性具有一定的抑制作用，且與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

注：與正常對照組比較，＊P< 0.05，# P< 0.001。

3 討 論

高脂血癥是由于體內(nèi)脂質代謝異常引起的一種疾病，由其導致的并發(fā)癥嚴重危害人類健康甚至生命。體內(nèi)脂質代謝主要由內(nèi)源性脂質合成、外源性脂質吸收、膽汁酸重吸收等多種相關靶點調控[7]，HMG-CoA還原酶是其中的靶點之一，也是降血脂藥物研究中最經(jīng)典的靶點。目前臨床上應用最廣泛的HMG-CoA還原酶抑制劑為他汀類藥物，此類藥物在降血脂方面效果良好[8]。但是長期服用他汀類藥物，仍存在一些不良反應，如血糖異常、肝酶異常、記憶和認知障礙等[9]。近年來，大量研究證實中藥在降脂方面有其獨特的優(yōu)勢，藥源豐富，不良反應少；成分復雜，在體內(nèi)可以通過多途徑多靶點發(fā)揮降血脂作用，臨床療效明確且顯著[10-11]。因此，中藥降脂逐漸被臨床醫(yī)生和病人認可，且臨床應用前景廣闊。燈銀腦通膠囊為中藥組合物，主要由燈盞細辛、銀杏葉、三七和滿山香四味中藥組成，有研究表明燈盞細辛、銀杏葉、三七均有不同程度的降血脂作用[12-14]，但由于藥用成分比較復雜，作用靶點尚未明確。

斑馬魚作為一種新興的模式生物，彌補了哺乳動物沒有或難做的模型，打破了藥物研發(fā)中的動物模型瓶頸。斑馬魚高血脂模型用于降血脂研究已有大量文獻報道[15-16]，該方法操作便捷、實驗周期短、穩(wěn)定可靠。本研究中，燈銀腦通膠囊對斑馬魚降血脂的作用呈現(xiàn)“量增而效先增后減”的量效關系[17]，即在7.500 μg/mL時對斑馬魚的降血脂作用達到最高，而隨濃度升高，降脂作用反而下降，原因可能有以下幾點：①與靶點的親和力，隨濃度升高，燈銀腦通膠囊有效成分與其他靶點結合的親和力較強，和降血脂靶點結合減弱；②成分之間的拮抗作用，由于燈銀腦通膠囊成分比較復雜，濃度升高到一定程度時，其他成分與起降血脂作用的有效成分產(chǎn)生拮抗作用，使得降血脂作用被抵消，最終導致燈銀腦通膠囊降血脂作用降低；③燈銀腦通膠囊的一些成分可能影響藥物在體內(nèi)的吸收、代謝和作用，劑量越高對藥效影響越大。因此，本研究為臨床降血脂研究中燈銀腦通膠囊的藥物濃度選擇和質量控制提供了理論依據(jù)。體外酶促反應結果表明HMG-CoA還原酶可能是燈銀腦通膠囊降血脂的作用靶點之一，但由于其成分復雜，且體內(nèi)調控脂質代謝的靶點較多，推測燈銀腦通膠囊對其他靶點可能也有一定的調節(jié)作用。本研究是暨燈銀腦通膠囊上市以來首個通過規(guī)范的動物模型和酶學模型對藥物的藥效學進行系統(tǒng)的評價，后續(xù)將循靶點藥理學理論對燈銀腦通膠囊降血脂的分子機制做進一步的研究。本研究也為燈銀腦通膠囊的臨床推廣奠定了理論基礎。