宋劍南，陶 輝，丁季飛，徐盛松，石開虎

心肌纖維化是指在多種病理性因素刺激下心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)中心肌膠原過(guò)量沉積及比列失調(diào)為主要表現(xiàn)的一種病理性過(guò)程，在房顫、心衰和心肌病等多種心臟疾病中普遍存在，但其發(fā)生發(fā)展機(jī)制迄今仍不明確[1-2]。其中，心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts, CFs)的活化增殖使心肌間質(zhì)中膠原沉積，其作用在心肌纖維化的病變發(fā)生發(fā)展中十分關(guān)鍵[3]。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding protein, IGFBP)是一組與體內(nèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors, IGFs)結(jié)合對(duì)細(xì)胞多種生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生影響的關(guān)鍵性分子蛋白。其中胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein-3,IGFBP-3)是IGFBP系列中最主要的一種，在體內(nèi)循環(huán)中占很高的比例，是IGFs的主要結(jié)合受體[4]。研究[5-6]表明，IGFBP-3與一些器官的纖維化有關(guān)，特別在肝纖維化中常有相關(guān)報(bào)道，但在心肌纖維化的病變中的研究報(bào)道甚少。現(xiàn)通過(guò)建立相關(guān)的動(dòng)物和細(xì)胞模型，檢測(cè)IGFBP-3在大鼠心肌纖維化和CFs活化增殖中的分子表達(dá)，分析其在心肌纖維化病變過(guò)程中起到相關(guān)的促進(jìn)或抑制作用，從而為IGFBP-3在心肌纖維化的診斷與治療提供新的依據(jù)，并探索心肌纖維化可能的發(fā)病原理與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 在同樣環(huán)境下給予相同且足夠的水和飼料喂養(yǎng)動(dòng)物，選40只6周左右SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±30)g；40只約10 g的清潔級(jí)SD乳鼠，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心選購(gòu)，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk(皖)2017-001。

1.1.2藥品與試劑 鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride,ISO)(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：41170302)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Peprotech，美國(guó))；CCK-8試劑(Sigma公司，美國(guó))；Western blot技術(shù)相關(guān)的一、二抗(Bioworld Technology公司，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，日本)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3主要儀器 EPS電泳儀(上海天能科技有限公司，中國(guó))；PCR儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))；Western blot 技術(shù)相關(guān)的顯影設(shè)備；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 公司，德國(guó))，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和纖維化模型的構(gòu)建 40只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組和模型組。在相同飼養(yǎng)環(huán)境下，模型組每天腹部皮下注射ISO(5 mg/kg)，連續(xù)注射2周，建立SD大鼠心肌纖維化模型。對(duì)照組連續(xù)注射2周予以腹部皮下注射等劑量的生理鹽水。

1.2.2大鼠纖維化心肌標(biāo)本的采集和處理 將處理后的模型組和對(duì)照組的大鼠處死，開胸取出大鼠心臟，等質(zhì)量將心臟分為2份，取大鼠心房組織用于實(shí)驗(yàn)。其中1份用甲醛溶液脫水后，液體石蠟包埋，將包埋好的心肌組織切片，每片厚5 μm，以留下一步實(shí)驗(yàn)。剩余心臟組織置于-80 ℃冷箱待用。

1.2.3HE、Masson染色及膠原容積分?jǐn)?shù)測(cè)定 將切片的心肌組織烘烤后用二甲苯脫去切片中的石蠟再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精沖洗。用蘇木精染色后蒸餾水沖洗；經(jīng)過(guò)鹽酸酒精的分化后返藍(lán)，蒸餾水沖洗后脫水處理，繼續(xù)HE、Masson染色。圖片采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，每張切片取3個(gè)無(wú)血管的視野，計(jì)算心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)CVF(%)=膠原面積/全視野面積×100%。

1.2.4SD乳鼠CFs的提取與培養(yǎng) 將SD乳鼠用乙醇浸泡30 s后，開胸取出心臟，用PBS清洗3次，擠出血凝塊。將心臟放至高壓滅菌5 ml EP管中，將心臟充分碾碎，加入3 ml Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶的混合酶液(Ⅰ型膠原酶 ∶胰蛋白酶比例為1 ∶2)，37 ℃水浴消化，靜置后，取上清液移至新EP管中，加入等量培養(yǎng)基混合，將EP管放入低速離心機(jī)上(900 r/min離心8 min)，重復(fù)上述操作3次。細(xì)胞培養(yǎng)1.5 h后再次更換培養(yǎng)基。通過(guò)高倍顯微鏡鑒別CFs，將提取成功的細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，傳至3～4代可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.5細(xì)胞分組 在相同條件下將CFs等細(xì)胞數(shù)量的種于培養(yǎng)皿中。對(duì)照組：正常未經(jīng)處理的CFs；模型組：CFs使用5 ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)分別刺激24、48 h，使其活化。對(duì)照組和模型組均培育相同的時(shí)間后處理。

1.2.6CCK-8檢測(cè)TGF-β1刺激的CFs增殖情況 將CFs分為3組，模型組：TGF-β1刺激CFs增殖24、48 h，對(duì)照組：未加TGF-β1刺激在相同條件下培養(yǎng)的CFs。培養(yǎng)完成后用以細(xì)胞密度為3×106/L加于96孔板中，每孔100 μl，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后處理。每孔加入10 μl CCK-8試劑，避光孵育2 h后測(cè)定光密度(optical density,OD)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3次。

1.2.7Western blot法檢測(cè)IGFBP-3、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型膠原前膠原A1( type Ⅰ collagen procollagen A1,COL1A1)的蛋白表達(dá) 分別提取心肌組織和細(xì)胞的總蛋白，測(cè)蛋白濃度后，將蛋白保存于-80 ℃冰箱待用。配制相應(yīng)膠后，上樣后用SDS-PAGE 蛋白電泳體系進(jìn)行電泳，經(jīng)過(guò)濕轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜2×10 min，脫脂牛奶封閉1 h，洗膜4×10 min，搖床上4 ℃孵育IGFBP-3、α-SMA、β-actin、COL1A1 的一抗(根據(jù)說(shuō)明書，IGFBP-3抗體用一抗稀釋液以1 ∶800進(jìn)行稀釋，α-SMA、β-actin、COL1A1抗體以1 ∶1 000進(jìn)行稀釋)，過(guò)夜后，再次洗膜4×10 min，二抗(用10 ml二抗稀釋液加入抗兔/山羊抗鼠的二抗1 μl進(jìn)行稀釋)室溫孵育90 min，洗膜4次，每次10 min，最后蛋白采用ECL法顯影。蛋白條帶采用Quantity One V 4.6軟件進(jìn)行分析，進(jìn)行吸光度值的檢測(cè)，計(jì)算出蛋白表達(dá)水平。

1.2.8qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)IGFBP-3、α-SMA和COL1A1的mRNA表達(dá) 提取心肌組織和CFs的總RNA，測(cè)定純度和濃度后，按照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄后cDNA放在-80 ℃保存。使用qRT-PCR檢測(cè)目的基因。反應(yīng)條件：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min預(yù)變性；95 ℃、20 s變性，60 ℃、30 s退火，72 ℃、30 s延伸，40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增階段；以95 ℃、15 s，60 ℃、1min，95 ℃、15 s為熔解曲線階段。以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。表1為相關(guān)引物序列。

表1 IGFBP-3、α-SMA、β-actin 和COL1A1的qPCR的引物序列

2 結(jié)果

2.1 HE、Masson染色及膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF)測(cè)定分析如圖1示，HE染色中藍(lán)染的為細(xì)胞核，紅染的為胞質(zhì)和胞外基質(zhì)；Masson染色心肌紅染、心肌間質(zhì)膠原纖維為藍(lán)染。從2種染色中可以觀察到，與對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞增生肥大且排列紊亂，胞外纖維組織明顯增多。CVF比較：模型組大鼠心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)百分比明顯高于陰性對(duì)照組(t=49.38，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組與對(duì)照組的膠原纖維CVF(%)比較見表2。

圖1 兩組大鼠心肌組織HE和Masson染色的比較 ×400

組別CVF(%) 對(duì)照1.72±0.35 模型12.45±1.29?

與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.2 注射ISO后對(duì)大鼠心肌組織中IGFBP-3、α-SMA和COL1A1蛋白的影響大鼠動(dòng)物模型中，在大鼠心肌組織中IGFBP-3蛋白表達(dá)水平模型組比對(duì)照組明顯增高(t=37.72，P<0.05)，α-SMA蛋白表達(dá)含量模型組比對(duì)照組明顯增高(t=56.03，P<0.05)，COL1A1的蛋白表達(dá)水平模型組高于對(duì)照組(t=43.38，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

2.3 注射ISO后對(duì)大鼠心肌組織中IGFBP-3、α-SMA和COL1A1 mRNA表達(dá)的影響以β-actin內(nèi)參檢測(cè)mRNA的表達(dá)，IGFBP-3的mRNA表達(dá)水平模型組明顯高于對(duì)照組(t=46.21，P<0.05)，α-SMA的mRNA表達(dá)水平模型組比對(duì)照組顯著增高(t=36.37，P<0.05)，COL1A1的mRNA表達(dá)水平模型組高于對(duì)照組(t=79.58，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖2 對(duì)照組和模型組IGFBP-3、α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)的變化與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖3 對(duì)照組和模型組IGFBP-3、α-SMA和COL1A1 mRNA表達(dá)的比較與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.4 CCK-8法檢測(cè)TGF-β1刺激后CFs的細(xì)胞活力CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，加入TGF-β1刺激24 h(t=43.42，P<0.05)和48 h(t=104.60，P<0.05)后CFs的細(xì)胞活力高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 加入TGF-β1刺激后對(duì)CFs中IGFBP-3、α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞模型中，用TGF-β1刺激24 h CFs所表達(dá)的IGFBP-3蛋白表達(dá)水平模型組明顯高于對(duì)照組(t=14.13，P<0.05)，α-SMA蛋白表達(dá)含量模型組與對(duì)照組比較顯著增高(t=26.29，P<0.05)，COL1A1的蛋白表達(dá)水平模型組高于對(duì)照組(t=13.83，P<0.05)，用TGF-β1刺激48 h的CFs比對(duì)照組表達(dá)的IGFBP-3(t=62.59，P<0.05)、α-SMA(t=129.30，P<0.05)、COL1A1(t=63.61，P<0.05)的蛋白含量明顯增高，且刺激48 h CFs的IGFBP-3(t=28.99，P<0.05)、α-SMA(t=105.25，P<0.05)、COL1A1(t=10.89，P<0.05)的蛋白含量高于刺激24 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖4 對(duì)照組和用TGF-β1刺激CFs 24、48 h的細(xì)胞活力比較A：未加TGF-β1刺激的CFs(對(duì)照組)；B：TGF-β1刺激24 h的CFs；C：TGF-β1刺激48 h的CFs；與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖5 TGF-β1刺激后的CFs模型組與對(duì)照組IGFBP-3、α-SMA和COL1A1的表達(dá)比較A：未加TGF-β1刺激的CFs蛋白表達(dá)；B：TGF-β1刺激24h的CFs蛋白表達(dá)；C：TGF-β1刺激48h的CFs蛋白表達(dá)；與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.6 加入TGF-β1刺激后對(duì)CFs中IGFBP-3、α-SMA和COL1A1 mRNA表達(dá)的影響以β-actin作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法檢測(cè)mRNA的表達(dá)，TGF-β1刺激24 h后CFs所表達(dá)的IGFBP-3(t=45.00，P<0.05)、α-SMA(t=20.15，P<0.05)、COL1A1(t=58.20，P<0.05)的mRNA含量升高，同樣，TGF-β1刺激48 h后CFs所表達(dá)的IGFBP-3(t=17.77，P<0.05)、α-SMA(t=26.29，P<0.05)、COL1A1(t=37.24，P<0.05)的mRNA含量亦升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。

圖6 對(duì)照組與TGF-β1刺激的CFs 24 h和48 h的模型組的IGFBP-3、α-SMA和COL1A1的mRNA含量比較A：未加TGF-β1刺激CFs的mRNA表達(dá)(對(duì)照組)；B：TGF-β1刺激24 h CFs的mRNA表達(dá)；C：TGF-β1刺激48 h CFs的mRNA表達(dá)；與對(duì)照組比較：*P<0.05

3 討論

心肌纖維化是心臟在多病理因素下相互作用、共同參與的結(jié)果。而心肌成纖維細(xì)胞增殖、活化及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積和膠原比例失調(diào)，可進(jìn)一步形成心肌纖維化[7-8]。在心肌纖維化中α-SMA、COL1A1等蛋白過(guò)度表達(dá)，可作為心肌纖維化的檢測(cè)指標(biāo)。

IGFBP調(diào)節(jié)IGFs與其受體的結(jié)合，對(duì)細(xì)胞內(nèi)IGFR相關(guān)的其他信號(hào)的同類傳導(dǎo)與表達(dá)產(chǎn)生影響。IGFBP-3在體內(nèi)主要由肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，但在其他器官細(xì)胞中也有表達(dá)，通過(guò)自分泌和旁分泌對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生作用[9-10]。相關(guān)研究[11-13]表明，在心衰、心肌梗死等一些心血管疾病中促進(jìn)IGFBP-3的表達(dá)可抑制IGF-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以阻斷IGF-1R/PI3K/Akt通路發(fā)揮出抑制細(xì)胞活化的作用，IGFBP-3在一些腫瘤的增殖過(guò)程中也發(fā)揮拮抗增殖的作用，可促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。從以上可分析在心肌纖維化的病變和CFs活化增殖過(guò)程中，IGFBP-3表達(dá)升高可能抑制細(xì)胞的活化，對(duì)心肌纖維化可能產(chǎn)生抑制作用。

通過(guò)構(gòu)建大鼠心肌纖維化及CFs活化的模型，檢測(cè)模型中IGFBP-3的表達(dá)含量并與對(duì)照組作對(duì)比。動(dòng)物模型建立后心肌纖維化病理表現(xiàn)明顯，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，加入TGF-β1刺激后細(xì)胞增殖活化明顯，檢測(cè)模型組中α-SMA、COL1A1表達(dá)明顯升高，結(jié)合以往文獻(xiàn)[14-15]，說(shuō)明其建立動(dòng)物和細(xì)胞模型的方法可行。在動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中，模型組中IGFBP-3表達(dá)含量增高，說(shuō)明纖維化心肌和活化CFs可影響組織和細(xì)胞中IGFBP-3的表達(dá)。

綜上所述，在心肌纖維化的病理過(guò)程中IGFBP-3的表達(dá)水平明顯升高，表明IGFBP-3可能參與心肌纖維化的病變過(guò)程并在其發(fā)生機(jī)制中起著重要作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確，有待深入研究。