李 琛，楊曉光，錢海紅，陳麗萍，蘇 菁，馮 萍，侯海軍，張志華

據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，2014年我國(guó)居民肺癌發(fā)病和死亡例數(shù)均位居第一位，嚴(yán)重威脅國(guó)民健康[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌總數(shù)的85%以上，其生長(zhǎng)分裂增殖較慢，轉(zhuǎn)移擴(kuò)散較晚。近年來，盡管NSCLC診療手段不斷提高，但其五年生存率仍較低。從分子生物學(xué)水平，尋找敏感度高、特異性強(qiáng)的標(biāo)志物已成為NSCLC早期診斷、治療評(píng)估和預(yù)后監(jiān)測(cè)的研究熱點(diǎn)，同時(shí)為腫瘤的放化療、靶向治療提供新的技術(shù)支撐[2-3]。

三結(jié)構(gòu)域蛋白59(tripartite motif-59,TRIM59)系TRIM蛋白超家族的重要成員之一，于2011年由Valiyeva et al[4]首次在小鼠前列腺癌癥模型中證實(shí)其是致癌基因，在隨后的研究中逐漸證實(shí)TRIM59在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用[5-7]。但TRIM59在NSCLC組織中的研究較少，且相關(guān)致癌機(jī)制不明確。該研究通過RT-PCR法和免疫組化法檢測(cè)TRIM59基因和蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)，分析TRIM59蛋白與NSCLC臨床病理特征和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-myc、CDC25A的相關(guān)性，初步探討TRIM59的致癌機(jī)制，并結(jié)合生存時(shí)間的隨訪，為NSCLC的早期診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供準(zhǔn)確、可靠的生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究共納入2012年2月～2014年2月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理確診的NSCLC組織和正常肺組織標(biāo)本各40例，同時(shí)收集患者完整的臨床資料，本研究經(jīng)該院倫理委員會(huì)鑒定批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要試劑和儀器 RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑購自日本Takara公司；SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；TRIM59和GAPDH引物由生工生物(北京)有限公司設(shè)計(jì)合成；全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自瑞士羅氏公司；E2010、DEPC水購自美國(guó)Sigma公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司；兔抗人TRIM59單克隆抗體、兔抗人c-myc、CDC25A多克隆抗體均購自美國(guó)Santa Cruz 公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)TRIM59 mRNA表達(dá) 提取總RNA并定量，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。TRIM59引物，上游5′-CCTGTGTTTGAGATAGATTTAAGAGC-3′，下游5′-GCAACAAGGTGAGACCCAGT-3′；GAPDH引物，上游5′-AAATCCCATCACCATCTTCC-3′，下游5′-TCACACCCATGACGAACA-3′。

PCR反應(yīng)試劑：SYBR Premix Ex Taq 5 ml，PCR forward primer 0.2 μl，PCR reverse primer 0.2 μl，ROX Reference Dye 0.2 μl，cDNA 模板100 ng，DEPC水共10 μl。輕柔混勻，離心。PCR反應(yīng)體系，95 ℃孵育30 s；95 ℃孵育5 s，60 ℃孵育20 s，反應(yīng)共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；然后72 ℃孵育20 s，95 ℃孵育15 s終止反應(yīng)。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理使用2ΔΔCt法，計(jì)算各樣本Ct平均值(Ct=Ctnetl-Ctl3actin)。其中，中位數(shù)以上為高表達(dá)，以下則考慮低表達(dá)。

1.2.3免疫組化法檢測(cè)TRIM59的表達(dá)及判定 10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精-伊紅染色，病理診斷。80 ℃烤箱烘烤30 min，脫水，內(nèi)源性過氧化物酶滅活，高溫高壓水化修復(fù)；加入一抗(1 ∶ 400)50 μl，4 ℃冰箱中孵育過夜；加入二抗50 μl，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化，各級(jí)乙醇(70%、75%、85%、90%、95%、100%)逐次脫水，松節(jié)油透明和樹膠行封片處理，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，光鏡下觀察。

應(yīng)用半定量積分法，包括陽性細(xì)胞數(shù)占視野百分比與陽性強(qiáng)度，TRIM59、c-myc蛋白以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色、棕黃色為陽性表達(dá)，而CDC25A染色主要定位于細(xì)胞核，其中陽性細(xì)胞計(jì)分：≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。陽性強(qiáng)度：淺黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，紅褐色計(jì)3分。二者相乘計(jì)為總分，0分計(jì)為-，1～4分計(jì)為+，5～8分計(jì)為，9～12分計(jì)為，-為陰性，+為弱陽性，～為強(qiáng)陽性。

1.3 隨訪通過門診復(fù)查、電話隨訪，時(shí)間為2018年11月30日。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測(cè)TRIM59 mRNA表達(dá)以TRIM59/GAPDH比值作為RT-PCR定量分析，與TRIM59 mRNA在正常組中的表達(dá)相比，NSCLC組中TRIM59 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.901，P=0.002)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)NSCLC組和正常組中的TRIM59 mRNA表達(dá)情況與正常組比較：*P<0.05

2.2 免疫組化檢測(cè)TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白的表達(dá)與TRIM59、c-myc、CDC25A在正常組中陽性表達(dá)水平[15.00%(6/40)、10.00%(4/40)、17.50%(7/40)]相比，三者在NSCLC組陽性表達(dá)[72.50%(29/40)、67.50%(27/40)、60%(24/40)]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.775，χ2=35.419，χ2=28.916，P=0.000)。見圖2。

2.3 NSCLC組織中TRIM59的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系NSCLC組中TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白的表達(dá)水平均與病變分化程度、TNM分期、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別無關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.4 NSCLC組織中TRIM59的表達(dá)與c-myc、CDC25A蛋白表達(dá)的相關(guān)性NSCLC組中TRIM59蛋白的表達(dá)與c-myc蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.451，P=0.000)，而與CDC25A蛋白的表達(dá)亦呈明顯相關(guān)性(r=0.421，P=0.002)。

2.5 TRIM59蛋白的表達(dá)情況與NSCLC患者生存的相關(guān)性分析TRIM59陽性組患者5年死亡率為65.52%(19/29)，而陰性組患者為36.36%(4/11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.275，P=0.000)；生存曲線結(jié)果顯示，TRIM59陽性組中位生存期為29個(gè)月，而TRIM59陰性組為56個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.275，P=0.003)。見圖3。

圖2 免疫組化檢測(cè)正常組和NSCLC中TRIM59、c-myc、CDC25A的陽性表達(dá) SP×200A：TRIM59在正常組中的陽性表達(dá)；B：TRIM59在NSCLC中的陽性表達(dá)；C：c-myc在正常組中的陽性表達(dá)；D：c-myc在NSCLC中的陽性表達(dá)；E：CDC25A在正常組中的陽性表達(dá)；F：CDC25A在NSCLC中的陽性表達(dá)

圖3 TRIM59蛋白表達(dá)與NSCLC患者生存期的相關(guān)性

2.6 Cox回歸分析Cox回歸模型分析顯示，TRIM59表達(dá)水平(P=0.002)、脈管浸潤(rùn)(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)、肝轉(zhuǎn)移和TNM分期(P<0.001)均是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。見表2、3。

3 討論

三結(jié)構(gòu)域蛋白家族(tripartite motif，TRIM)是一個(gè)在進(jìn)化中高度保守的基因家族，由70多個(gè)成員組成，參與了多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育的過程，同時(shí)在細(xì)胞凋亡、炎癥和免疫應(yīng)答過程中亦發(fā)揮重要作用[8]。TRIM家族蛋白最顯著的結(jié)構(gòu)特征是包括一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(really interesting new gene,RING)、一個(gè)或兩個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域(B-box domain)和一個(gè)盤繞區(qū)域(coiled-coil domain)。RING結(jié)構(gòu)域是半胱氨酸富集的鋅離子結(jié)合域，具有廣泛的泛素化酶活性；B-box結(jié)構(gòu)域參與蛋白之間的相互連接；盤繞區(qū)域能夠介導(dǎo)成員自身發(fā)生同源寡聚，參與蛋白鏈接[9]。

表2 NSCLC組織中TRIM59與c-myc蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表3 NSCLC組織中TRIM59與CDC25A蛋白表達(dá)的相關(guān)性

TRIM59亦稱為MRFI，位于人類第3號(hào)染色體上，屬于C-XI亞家族成員， 除了繼承高度保守的三段結(jié)構(gòu)域外，在其C端還有一個(gè)涉及蛋白跨膜定位的TM 結(jié)構(gòu)域，參與TRIM59的定位。TRIM59蛋白位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，內(nèi)含403個(gè)氨基酸殘基，通過介導(dǎo)蛋白之間的相互作用，泛素化調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的無序化增殖[10]。研究[11]證實(shí)，TRIM59通過參與NF-κB和IRF3/IRF7介導(dǎo)的信號(hào)通路的活化，發(fā)揮免疫信號(hào)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。TRIM59參與SV40 Tag/p53/pRB和Ras/ERK/PI3K/AKT兩種致癌信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞周期S期的DNA合成，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，同時(shí)能上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，最終誘導(dǎo)腫瘤形成[12]。

c-myc是myc家族中的重要成員，能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，促進(jìn)其永生化、去分化和功能轉(zhuǎn)化，在多種腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用。CDC25A是CDC25家族中重要成員，能加速細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而增加細(xì)胞DNA的合成，使癌細(xì)胞獲得高增殖活性；同時(shí)能消除ATP錨定模序上Thr-14和Thr-15的磷酸化抑制，在細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)中發(fā)揮正性調(diào)控作用。

本研究從基因水平證實(shí)了在NSCLC組織中TRIM59 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組織，免疫組化結(jié)果證實(shí)TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常組織，同時(shí)TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白表達(dá)水平均與病變分化程度、TNM分期、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，進(jìn)一步相關(guān)分析表明TRIM59表達(dá)與c-myc、CDC25A均呈明顯正相關(guān)，提示TRIM59表達(dá)的異常在NSCLC發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，且與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，其致癌機(jī)制考慮與誘導(dǎo)c-myc、CDC25A蛋白上調(diào)有關(guān)。Hao et al[13]研究證實(shí)TRIM59 mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)水平顯著高于正常肺組織，且與吸煙、病變分期相關(guān)；Zhan et al[14]報(bào)道了TRIM59蛋白在各種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上升，而siRNA誘導(dǎo)TRIM59的下降在G2期抑制細(xì)胞周期中顯著抑制NSCLC細(xì)胞系的增殖和遷移，此外，TRIM59能影響許多細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)，包括CDC25C和CDK1的表達(dá)；國(guó)內(nèi)薛棟 等[15]通過免疫組化法證實(shí)肝癌組織中TRIM59的表達(dá)明顯高于正常肝組織，TRIM59異常表達(dá)與肝癌的發(fā)生及分化程度、分期相關(guān)，其致癌機(jī)制考慮與誘導(dǎo)Twist 表達(dá)上調(diào)和E-cadherin表達(dá)下調(diào)有關(guān)，以上研究均支持本研究結(jié)果。

本研究進(jìn)一步通過隨訪證實(shí)，TRIM59陽性患者死亡率明顯高于陰性患者，且TRIM59陽性表達(dá)患者生存期明顯短于陰性表達(dá)者，表明TRIM59的表達(dá)水平可作為NSCLC患者的重要預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)，同時(shí)Cox回歸模型分析亦證實(shí)TRIM59表達(dá)水平是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。