駱廣濤，湯為香，裘正軍

胰腺癌是一種惡性程度極高、預(yù)后極差的消化系統(tǒng)腫瘤[1-2]。吉西他濱是目前治療中晚期胰腺癌的一線化療藥物，但由于胰腺癌患者對吉西他濱存在固有及繼發(fā)性耐藥，臨床上吉西他濱的療效并不令人滿意。因此，研究胰腺癌吉西他濱耐藥的機制并尋找新的靶向治療藥物具有重要的臨床意義。

低氧微環(huán)境是胰腺癌的典型特征之一[3]。有研究[4-5]表明低氧條件下胰腺癌細胞中低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)蛋白累積和Akt信號通路活化，導(dǎo)致胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥性增強。MK-2206是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有生物活性的口服變構(gòu)類Akt抑制劑[6]。鑒于Akt信號通路在胰腺癌吉西他濱耐藥中的重要作用，該研究使用MK-2206與吉西他濱聯(lián)合用于探討低氧條件下胰腺癌細胞對吉西他濱敏感性的改變。

1 材料與方法

1.1 主要細胞系和試劑人胰腺癌細胞系MIA PaCa-2、BxPC-3、PANC-1、AsPC-1、CAPAN-2、HPAF-Ⅱ及SW1990由本課題組長期保存。DMEM、RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)及胎牛血清(FBS)購于美國Hyclone公司。MK-2206(貨號：S1078)及吉西他濱(貨號：S1149)購于美國SELLECK公司。二甲基亞砜(DMSO)購于北京鼎國昌盛公司。PAGE凝膠制備試劑盒購于上海熠晨公司。CCK-8購于日本同仁公司。人Total-Akt(Akt)、p-Akt(Ser473)及β-actin抗體、辣根過氧化酶標記的兔二抗和鼠二抗購于美國Cell Signaling Technology(CST)公司。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白抗體購于美國BD公司。ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) MIA PaCa-2、PANC-1、CAPAN-2及SW1990細胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。HPAF-Ⅱ細胞在含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。BxPC-3和AsPC-1細胞在含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。常氧處理時，胰腺癌細胞置于細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37 ℃、21% O2、5% CO2；低氧處理時，胰腺癌細胞置于低氧培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37 ℃、1% O2、5% CO2。

1.2.2Western blot法檢測胰腺癌細胞低氧標志分子HIF-1α、p-Akt(Ser473)及Akt蛋白的表達改變 ① 首先課題組擬通過三氣培養(yǎng)箱建立低氧微環(huán)境。將胰腺癌細胞系(MIA PaCa-2、BxPC-3、PANC-1、CAPAN-2及SW1990、HPAF-Ⅱ及AsPC-1細胞)在低氧條件下(氧氣濃度1%)培養(yǎng)48 h，并以常氧條件培養(yǎng)(氧氣濃度21%)的細胞作為對照，使用Western blot檢測HIF-1α蛋白表達改變；② 為檢測低氧條件下胰腺癌細胞中Akt信號通路的表達改變，本課題組將MIA PaCa-2、BxPC-3及PANC-1細胞置于常氧和低氧條件下培養(yǎng)48 h，使用Western blot檢測MIA PaCa-2和BxPC-3細胞中p-Akt(Ser473)和Akt表達改變。 ③ 為探討常氧及低氧條件下MK-2206對Akt信號通路的影響，本課題組查閱文獻后選擇1 μmol/L MK-2206處理胰腺癌細胞(MIA PaCa-2及BxPC-3)。常氧和低氧條件下使用1 μmol/L MK-2206分別處理MIA PaCa-2和BxPC-3細胞48 h，使用Western blot檢測p-Akt(Ser473)、Akt的表達改變。

Western blot實驗步驟如下：配制SDS-PAGE膠，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。用移液槍將蛋白樣品緩慢加入到SDS-PAGE膠孔內(nèi)進行電泳。電泳結(jié)束后，卸下膠板并組裝“三明治”轉(zhuǎn)膜裝置開始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為300 mA、100 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后配制5%脫脂牛奶，常溫搖床封閉膜1 h。封閉結(jié)束用TBS輕輕洗滌1次，4 ℃搖床用一抗(一抗?jié)舛菻IF-1α 1∶1 000， p-Akt 1 ∶1 000，Akt 1 ∶1 000, β-actin 1 ∶3 000)孵育過夜。次日回收一抗，TBS洗10 min，共3次。常溫搖床用二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，TBS洗10 min，共3次。ECL顯影液A液和B液1 ∶1混合后，均勻鋪在膜上，顯影并保存曝光結(jié)果。

1.2.3CCK-8細胞毒性實驗 常氧和低氧條件下MK-2206與吉西他濱聯(lián)合處理胰腺癌細胞后使用CCK-8細胞毒性實驗檢測胰腺癌細胞對吉西他濱敏感性的改變。對數(shù)生長期細胞消化后離心，加入2 ml培養(yǎng)基重懸并進行細胞計數(shù)。用多通道移液槍斜貼著培養(yǎng)板加入100 μl細胞懸液(MIA PaCa-2 細胞每孔種5 000個細胞，BxPC-3細胞每孔種10 000個細胞)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。按照實驗設(shè)定分為DMSO組、MK-2206組、吉西他濱組和MK-2206+吉西他濱組。根據(jù)實驗分組向96孔板加入DMSO、MK-2206(1 μmol/L)、吉西他濱(10 μmol/L)和MK-2206(1 μmol/L)+吉西他濱(10 μmol/L)，并設(shè)定空白對照和陰性對照，每個濃度3個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)板置于常氧和低氧培養(yǎng)箱中孵育48 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，孵育1 h后使用酶標儀測定450 nm處的光密度(optical density，OD)值。根據(jù)以下公式計算細胞活力，細胞活力=(實驗組平均OD值-空白對照組平均OD值)/(陰性對照組平均OD值-空白對照組平均OD值)。

2 結(jié)果

2.1 低氧處理胰腺癌細胞后HIF-1α蛋白表達變化結(jié)果顯示常氧培養(yǎng)的MIA PaCa-2細胞中HIF-1α蛋白幾乎不表達，而低氧培養(yǎng)MIA PaCa-2細胞48 h后HIF-1α蛋白出現(xiàn)累積，為常氧組HIF-1α蛋白表達水平的3.55倍(經(jīng)β-actin歸一化)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.614,P=0.005)；BxPC-3細胞在常氧條件下HIF-1α蛋白出現(xiàn)少量累積，而低氧條件下培養(yǎng)BxPC-3細胞48 h后HIF-1α蛋白表達水平為常氧組HIF-1α蛋白的3.86倍(經(jīng)β-actin歸一化)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.195,P=0.004)。此外， PANC-1、AsPC-1、CAPAN-2、HPAF-Ⅱ及SW1990等常見的胰腺癌細胞系在低氧條件下培養(yǎng)48 h后HIF-1α蛋白累積增加：其中低氧條件下PANC-1細胞HIF-1α蛋白表達水平是常氧的2.41倍(t=5.455,P=0.032)；AsPC-1細胞HIF-1α蛋白表達水平是常氧的1.58倍(t=4.376,P=0.048)；CAPAN-2細胞HIF-1α蛋白表達水平是常氧的2.14倍(t=11.549,P=0.007)；HPAF-Ⅱ細胞HIF-1α蛋白表達水平是常氧的3.37倍(t=11.103,P=0.008)；SW1990細胞HIF-1α蛋白表達水平是常氧的2.15倍(t=7.452,P=0.018)。見圖1。上述結(jié)果表明通過三氣培養(yǎng)箱成功構(gòu)建起低氧微環(huán)境模型。

2.2 低氧條件下胰腺癌細胞Akt信號通路表達改變?nèi)鐖D2所示，低氧條件下MIA PaCa-2細胞p-Akt(Ser473)表達水平升高；p-Akt(Ser473)/Akt的相對表達量(經(jīng)β-actin歸一化)是常氧環(huán)境的2.43倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.544,P=0.017)。BxPC-3細胞在低氧條件下培養(yǎng)48 h后p-Akt(Ser473)的表達水平升高；p-Akt(Ser473)/Akt的相對表達量(經(jīng)β-actin歸一化)是常氧條件的3.24倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.821,P=0.040)。此外，在PANC-1細胞中同樣發(fā)現(xiàn)低氧條件下p-Akt (Ser473)表達水平較常氧增高，其p-Akt(Ser473)/Akt的相對表達量是常氧環(huán)境的31.33倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.318,P=0.003)，見圖2。上述結(jié)果表明，胰腺癌細胞中Akt信號通路在低氧環(huán)境中活化。

圖1 胰腺癌細胞系在物理低氧處理后HIF-1α蛋白表達改變 A：胰腺癌細胞系在物理低氧(1% O2)處理48 h后HIF-1α蛋白表達改變；B：目的蛋白HIF-1α的灰度值以及對應(yīng)條帶的內(nèi)參β-actin的灰度值(經(jīng)β-actin歸一化)；N：常氧處理組； H：低氧處理組；與常氧處理組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 低氧條件下MK-2206抑制胰腺癌細胞Akt信號通路活化如圖3所示，常氧和低氧條件下1 μmol /L MK-2206能抑制MIA PaCa-2和BxPC-3細胞p-Akt(Ser473)的活化。常氧狀態(tài)下MIA PaCa-2細胞經(jīng)MK-2206處理后p-Akt(Ser473)/Akt的相對表達量(經(jīng)β-actin歸一化)是DMSO組的0.05倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.185,P=0.000)；低氧條件下MIA PaCa-2細胞經(jīng)MK-2206處理后p-Akt(Ser473)/Akt的相對表達量(經(jīng)β-actin歸一化)是DMSO組的0.03倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.553,P=0.000)，見圖3A、3C。BxPC-3細胞在常氧條件下經(jīng)MK-2206處理后p-Akt(Ser473)/Akt的相對表達量(經(jīng)β-actin歸一化)是DMSO組的0.17倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.103,P=0.001)；低氧條件下BxPC-3細胞經(jīng)MK-2206處理后p-Akt(Ser473)/Akt的相對表達量(經(jīng)β-actin歸一化)是DMSO組的0.07倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.464,P=0.000)，見圖3B、3D。上述結(jié)果表明，在常氧和低氧條件下MK-2206能有效抑制胰腺癌細胞Akt信號通路活化。

2.4 低氧條件下MK-2206增強胰腺癌細胞對吉西他濱敏感性如圖4A所示，低氧條件下MIA PaCa-2細胞MK-2206(1 μmol/L)與吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組細胞活力為0.549±0.001，低于DMSO與吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組0.632±0.017，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.107,P=0.007)；而常氧條件下MIA PaCa-2細胞MK-2206(1 μmol/L)與吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組細胞活力為0.610±0.033，與DMSO和吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組0.556±0.018，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.525,P=0.128)，見圖4A。在BxPC-3細胞中同樣發(fā)現(xiàn)與DMSO和吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組(細胞活力為0.594±0.106)相比，低氧條件下MK-2206(1 μmol/L)與吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組細胞活力降低(細胞活力為0.508±0.041)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.363,P=0.033)，見圖4B。綜上結(jié)果表明，低氧條件下使用MK-2206抑制Akt信號通路后能增強胰腺癌細胞對吉西他濱敏感性。

圖2 低氧條件下胰腺癌細胞中p-Akt(Ser473)表達改變A：MIA PaCa-2、BxPC-3及PANC-1細胞在常氧(N)和低氧(H)條件下培養(yǎng)48 h后p-Akt(Ser473)的表達改變；B：目的蛋白p-Akt、Akt的灰度值以及對應(yīng)條帶的內(nèi)參β-actin的灰度值(經(jīng)β-actin歸一化)；與常氧處理組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

Akt信號通路的異?；罨c胰腺癌吉西他濱耐藥密切相關(guān)[7]。因此，針對Akt信號通路所研發(fā)的靶點抑制劑被認為是具有潛在逆轉(zhuǎn)吉西他濱耐藥作用，具有巨大的研究價值以及良好的臨床應(yīng)用前景。MK-2206 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型具有生物活性口服變構(gòu)類Akt抑制劑。在本研究中課題組發(fā)現(xiàn)MK-2206可在體外有效抑制胰腺癌細胞Akt信號通路的活化；此外本課題組還發(fā)現(xiàn)MK-2206能抑制胰腺癌細胞增殖(本文未顯示相關(guān)數(shù)據(jù))。這與文獻[8]報道MK-2206可以抑制腫瘤細胞增殖結(jié)論相符，即MK-2206能有效抑制腫瘤細胞內(nèi)Akt信號通路活化，發(fā)揮抗腫瘤增殖效應(yīng)。

已經(jīng)證實低氧惡劣環(huán)境下Akt信號通路參與到腫瘤細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、侵襲轉(zhuǎn)移以及化療耐藥過程[5,9-10]。Yokoi et al[5]首次發(fā)現(xiàn)低氧條件下胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥性增強。本課題組前期研究[11]證實低氧條件下胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥性增強，這與Yokoi et al[5]的研究結(jié)果相符。Yokoi et al[5]進一步研究表明其可能的機制是由于低氧激活了PI3K/Akt信號通路；使用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002能逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性。在本研究中本課題組發(fā)現(xiàn)低氧條件下胰腺癌細胞中Akt信號通路活化；此外，低氧條件下MK-2206能有效抑制Akt信號通路的活化并能增強胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性。

已經(jīng)有文獻[12-13]表明MK-2206能作為腫瘤細胞化療增敏劑發(fā)揮作用。Jin et al[12]發(fā)現(xiàn)MK-2206能有效抑制胃癌細胞內(nèi)Akt信號通路活化，并抑制細胞增殖；進一步研究發(fā)現(xiàn)MK-2206與阿霉素或5-氟尿嘧啶(5-Fu)聯(lián)用能增強胃癌細胞對阿霉素及5-Fu的敏感性。Whicker et al[13]發(fā)現(xiàn)MK-2206能抑制順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細胞Akt信號通路活化而發(fā)揮化療增敏劑的作用。上述研究均為MK-2206成為未來臨床腫瘤化療輔助藥物提供了有力支持。

盡管本研究顯示低氧條件下MK-2206能抑制Akt信號通路活化及增強胰腺癌細胞化療敏感性，但其作用于體內(nèi)還應(yīng)考慮很多因素，例如藥物吸收、分布及代謝等。因此，MK-2206能否用于胰腺癌患者目前還不能確定。此外，本研究僅選用了藥物的單一濃度(MK-2206 濃度為1 μmol/L；吉西他濱濃度為 10 μmol/L)，未進行MK-2206與吉西他濱聯(lián)合比例的實驗研究。在未來的研究中本課題組將通過體內(nèi)實驗進一步探討MK-2206對胰腺癌吉西他濱敏感性的影響。

圖3 常氧和低氧條件下MIA PaCa-2和BxPC-3細胞經(jīng)MK-2206處理后p-Akt的表達改變A、B：MIA PaCa-2和BxPC-3細胞經(jīng)1 μmol/L MK-2206處理后置于常氧和低氧條件下培養(yǎng)48 h后p-Akt、Akt和HIF-1α蛋白表達；C、D：MIA PaCa-2和BxPC-3細胞中目的蛋白p-Akt、Akt的灰度值以及對應(yīng)條帶的內(nèi)參β-actin的灰度值(經(jīng)β-actin歸一化)；與DMSO處理組比較：**P<0.01，***P<0.001

圖4 MK-2206和吉西他濱聯(lián)用后增強MIA PaCa-2和BxPC-3細胞對吉西他濱敏感性A：MIA PaCa-2細胞；B：BxPC-3細胞；與常氧處理組比較：*P<0.05，**P<0.01；與DMSO處理組比較：#P<0.05