齊亞楠 崔 彤 馬 婧 韓瑞鈺 安 琪 谷翊群 王樹(shù)松*

1.河北省胸科醫(yī)院(石家莊， 050041)；2.河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 ；3.河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院/國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所/國(guó)家衛(wèi)生健康委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

鋅-α2糖蛋白(ZAG)是一種可溶性糖蛋白，被認(rèn)為是一種新型的脂肪細(xì)胞因子，參與機(jī)體脂質(zhì)代謝。精子成熟過(guò)程中磷脂成分的改變、精卵結(jié)合以及精子細(xì)胞膜的流動(dòng)性均與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。鋅指蛋白32(ZBTB32)又稱睪丸鋅指蛋白，可直接與DNA結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[1]。目前，有關(guān) ZBTB32的研究多集中在細(xì)胞分化及免疫應(yīng)答等方面。有研究發(fā)現(xiàn)，ZBTB32 在睪丸組織尤其是減數(shù)分裂前期的粗線期精母細(xì)胞中表達(dá)最高，推測(cè)其可能與精子的發(fā)生密切相關(guān)[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建肥胖大鼠動(dòng)物模型，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ZAG和ZBTB32在睪丸組織中的定位，蛋白免疫印跡和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)ZAG和ZBTB32在大鼠睪丸、睪周脂肪中的表達(dá)，進(jìn)一步探索ZAG、ZBTB32與肥胖雄性大鼠生殖的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物肥胖模型的建立

于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，體重(103±11)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成研究組(高脂飼料喂養(yǎng))14只和對(duì)照組(普通飼料喂養(yǎng))6只，飼養(yǎng)期間自由進(jìn)水，12周末時(shí)計(jì)算大鼠平均體質(zhì)量。肥胖模型構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠體質(zhì)量超過(guò)對(duì)照組平均體質(zhì)量的20%，最終7只大鼠符合肥胖大鼠模型。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

取大鼠左側(cè)1/2睪丸組織固定于10%的甲醛溶液中，石蠟切片，脫蠟復(fù)水；枸櫞酸鈉抗原修復(fù)；SP-9001 生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ZAG和ZBTB32蛋白表達(dá)，其中ZAG、ZBTB 32抗體以1:100比例稀釋?zhuān)珼AB顯色，蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察ZAG和ZBTB32在兩組大鼠睪丸組織表達(dá)情況。采用Image-pro plus 6.0軟件測(cè)定ZAG和ZBTB32表達(dá)平均光密度值，分析ZAG、ZBTB32在兩組大鼠睪丸中的表達(dá)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(ZP404)分別提取睪丸組織及睪周脂肪組織總RNA，按照說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃15 s；63.2℃30 s；72℃30 s；共35個(gè)循環(huán)。在72℃30 s處收集熒光信號(hào)；最后72℃延伸5 min。內(nèi)參為β-actin，對(duì)照組為校準(zhǔn)樣品，以2-△△CT法計(jì)算研究組大鼠睪丸組織及睪周脂肪ZAG和ZBTB32 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參、ZAG和ZBTB32引物序列如下。

ZAG引物序列: F5’ TCTATGTGCAGCGAGCCAAG 3’,R 5’ AGTGGGAGGATCTGTTCGGT 3’ZBTB32引物序列: F5’ GGCCTCCATCTCTCCTGGTA 3’, R 5’ CGTTCATCCGGAGAGGGTTC 3’ β actin引物序列: F 5’ ACCCGCGAGTACAACCTTCT 3’,R 5’ GATGCCTCTCTTGCTCTGGG 3’

1.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

取大鼠睪丸及睪周脂肪于EP管中，向EP管中加500 ml已加入甲基磺酰氟的裂解液，充分剪碎并超聲裂解5 min，離心取上清，采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。以各組織最低蛋白濃度為參照計(jì)算蛋白上樣量，100℃煮沸10min；分離膠配制為10%，濃縮膠為5%，80 V恒壓30min，待電泳至濃縮膠底部時(shí)，將電壓轉(zhuǎn)置120V，轉(zhuǎn)膜條件為200 mA，1.5h；5%的脫脂奶粉封閉1.5 h；向膜上滴加稀釋的抗體(ZAG和ZBTB32以1:1000稀釋?zhuān)?actin 1:2000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜；再將標(biāo)記HPR的羊抗兔二抗(1:8000稀釋)室溫孵育1.5 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。采用Image J軟件測(cè)定目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，其中ZAG和ZBTB32蛋白相對(duì)表達(dá)量用目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，ZAG和ZBTB32在大鼠睪丸生精細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，見(jiàn)圖1(插頁(yè))。定量分析結(jié)果顯示，研究組大鼠睪丸組織中ZAG表達(dá)量(25.460±8.350)與對(duì)照組(37.670±18.070)相比無(wú)差異(P>0.05)，研究組大鼠睪丸組織中ZBTB32表達(dá)量(20.510±4.330)與對(duì)照組(25.960±7.360)相比無(wú)差異(P>0.05)。

2.2 大鼠睪丸和睪周脂肪中ZAG和ZBTB32mRNA相對(duì)表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果顯示，研究組較對(duì)照組大鼠在睪周脂肪ZAG mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.048±0.068，1.000±0.000)顯著降低(P<0.05)；在大鼠睪丸組織ZAG mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.820±0.760，1.000±0.000)無(wú)差異(P>0.05)；研究組和對(duì)照組ZBTB32 mRNA相對(duì)表達(dá)量在大鼠睪丸(0.994±0.770，1.000±0.000)及睪周脂肪組織(0.744±0.650，1.000±0.000)中均無(wú)差異(P>0.05)。

2.3 ZAG和ZBTB32在大鼠睪丸組織及睪周脂肪中蛋白表達(dá)

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，研究組大鼠睪周脂肪中ZAG蛋白表達(dá)量(0.751±0.030)低于對(duì)照組大鼠(1.116±0.021)(P<0.05)；而睪丸組織中ZAG蛋白表達(dá)量研究組(0.616±0.025)與對(duì)照組(0.605±0.033)無(wú)差異(P>0.05)；研究組ZBTB32在大鼠睪丸和睪周脂肪的表達(dá)量(1.514±0.057，0.376±0.007)與對(duì)照組(1.477±0.035，0.390±0.019)比較無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2(插頁(yè))。

3 討論

目前研究認(rèn)為，肥胖是導(dǎo)致雄性生育力低下的重要原因之一[3]。肥胖對(duì)雄性生殖的影響包括精液質(zhì)量下降、性腺功能減退及勃起功能障礙等，且父代肥胖可導(dǎo)致子代生殖器官發(fā)育遲緩，內(nèi)分泌功能紊亂，使睪丸容積和陰莖長(zhǎng)度減小等[4-5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠睪丸組織形態(tài)被明顯破壞，生精小管內(nèi)支持細(xì)胞和生精細(xì)胞減少，出現(xiàn)空泡樣改變；精液分析發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠精子濃度和精子活力顯著降低[6]；肥胖男性精子前向運(yùn)動(dòng)百分比顯著低于BMI正常男性[7]?？梢?jiàn)，肥胖對(duì)雄性生育力具有負(fù)面影響。

ZAG鏈至少可結(jié)合15個(gè)鋅離子，且ZAG結(jié)合鋅離子的多少影響其與游離脂肪酸和β-腎上腺素受體的結(jié)合能力[8-9]。ZAG作為重要的脂肪細(xì)胞因子可通過(guò)上調(diào)機(jī)體環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平、調(diào)節(jié)脂肪合成中關(guān)鍵酶或以自分泌、旁分泌的形式影響其他脂肪因子的合成而影響脂類(lèi)代謝[10-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，精漿ZAG含量與體質(zhì)量和腰圍呈負(fù)相關(guān)[7]；Russell 等[12]將純化的ZAG以不同的劑量分別注射小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZAG主要降低小鼠脂肪含量且存在時(shí)間依賴性和劑量依賴性；也有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中ZAG含量與mRNA呈正相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組和對(duì)照組大鼠睪丸組織ZAG蛋白和mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異，而睪周脂肪組織中研究組大鼠ZAG蛋白和mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組大鼠，推測(cè)ZAG對(duì)肥胖大鼠生殖的調(diào)控具有時(shí)間性，首先影響睪周脂肪組織，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

精漿ZAG含量與雄性生殖密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ZAG在大鼠生殖系統(tǒng)各個(gè)器官中均有表達(dá)且主要表達(dá)于附睪尾部，精漿中ZAG主要由附睪尾部上皮細(xì)胞分泌[14]，推測(cè)ZAG與精子成熟密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，血清中ZAG水平與精子生成密切相關(guān)的激素睪酮呈正相關(guān)[15]；重組ZAG抗體可使精子與透明帶的結(jié)合能力和頂體反應(yīng)顯著降低[16]。研究發(fā)現(xiàn)，精漿ZAG含量與精子濃度和精子總數(shù)呈負(fù)相關(guān)[7]。而本研究發(fā)現(xiàn)，研究組和對(duì)照組大鼠睪丸組織ZAG蛋白表達(dá)和ZAG mRNA表達(dá)均無(wú)差異，推測(cè)ZAG對(duì)精液質(zhì)量的影響可能更多的通過(guò)精漿微環(huán)境而發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)僅研究了睪丸及睪周脂肪組織，可進(jìn)一步檢測(cè)精漿ZAG含量和其在附睪及附屬性腺中的表達(dá)，以更加深入了解ZAG對(duì)肥胖雄性生殖的影響。

ZBTB32屬于POK蛋白家族，該家族成員N末端有一個(gè)BTB/POZ 結(jié)構(gòu)域，主要介導(dǎo)蛋白和蛋白之間的相互作用，C末端含有數(shù)個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，可直接與DNA結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，ZBTB32至少存在兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體1含有465個(gè)氨基酸，在睪丸組織中特異性表達(dá)，而異構(gòu)體2的N-末端缺乏BTB/POZ 結(jié)構(gòu)域，主要在T、B 淋巴細(xì)胞中表達(dá)，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答[1,17-18]。ZBTB32基因敲除小鼠睪丸支持細(xì)胞中雄激素受體的表達(dá)增加，同時(shí)曲細(xì)精管細(xì)胞凋亡減少[2]。有研究證實(shí)，ZBTB32 基因敲除小鼠的精子發(fā)生正常且可育，推測(cè)該基因可能不是生殖細(xì)胞形成過(guò)程中的必需基因，在精子發(fā)生中僅起到調(diào)節(jié)作用[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，ZBTB32 在大鼠睪丸生精細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，且研究組大鼠睪丸組織和睪周脂肪中ZBTB32蛋白和ZBTB32mRNA 表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)差異，推測(cè)ZBTB32基因表達(dá)可能與肥胖發(fā)生無(wú)關(guān)。

綜上所述，肥胖大鼠睪周脂肪組織ZAG表達(dá)顯著降低，提示肥胖可能導(dǎo)致ZAG表達(dá)異常，影響雄性生殖。