馮俊鵬 ， 徐 瑞，2 ， 唐玉玲 ， 嚴 翊

(1.北京體育大學運動人體科學學院 ， 北京 海淀 100084 ； 2.南京體育學院運動健康學院 ， 江蘇 南京 210014 ； 3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京 海淀 100193)

KISS-1/GPR54被認為是青春期啟動的“開關”，其中KISS-1調節(jié)生殖軸并作為青春期開始的分子開關[1]。隨著動物進入青春期，生殖激素開始發(fā)揮作用。下丘腦促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)可刺激垂體前葉分泌的促性腺激素(Gonadotropins,Gn)、黃體生成激素(Luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)增加。促性腺激素通過血液循環(huán)系統(tǒng)刺激、調節(jié)性腺的發(fā)育和功能。近幾年來，KISS-1已被鑒定為下丘腦-垂體-性腺軸的上調基因，KISS-1在哺乳動物繁殖中的作用得到了廣泛的研究。KISS-1主要由下丘腦神經(jīng)元分泌，并通過刺激GnRH神經(jīng)元上的同源受體GPR54起作用，然后激活調節(jié)青春期開始和生殖功能的下游基因。多年來關于KISS-1/GPR54研究的主要熱點都在HPG軸上游的定位和功能，目前已經(jīng)明確KISS-1/GPR54在多種組織中表達，特別是在胰腺和性腺中表達水平較高。

相關研究已經(jīng)在人類[2]、小鼠[3]、大鼠[4]和青蛙的睪丸中檢測到GPR54的表達，進一步增加了KISS-1也可以在睪丸發(fā)育中起作用的可能性。同時，KISS-1已被發(fā)現(xiàn)能在小鼠睪丸間質細胞內表達[5]。對于在人類精子中檢測出的KISS-1和GPR54，主要的部位局限于精子的頭部、頸部和鞭毛的中段[2]。然而，不同的研究對于KISS-1/GPR54在睪丸中的表達定位暫無一致結論，故暫無法推測KISS-1/GPR54在睪丸發(fā)育中的功能。由于在生長期過程中，大鼠睪丸結構和功能迅速成熟，故動態(tài)研究生長期過程中大鼠睪丸中KISS-1/GPR54表達的變化情況對于進一步探究KISS-1/GPR54在睪丸發(fā)育中的生理功能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級3周齡(第21天)離乳大鼠，共60只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證編號：SCXK京2012-0001)。經(jīng)北京體育大學動物福利倫理委員會批準(批準號：2016021A)，動物分籠飼養(yǎng)，室溫20～24 ℃，相對濕度40%～60%，每日12 h光照/12 h熄燈，大鼠自由飲水、飲食。飼料采用高脂對照飼料，購自美國Research Diets公司(貨號：D12451B)。

1.2 取樣 根據(jù)前期試驗結果和相關文獻，確定第21天、第35天、第43天、第56天為4個取材時間點。大鼠稱重后，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為0.025 mL/(kg·bw)。待麻醉后，腹主動脈取血，分別取兩側睪丸，剝離睪周脂肪及附睪后稱重，并將一側睪丸置于4%多聚甲醛中固定待用；另一側睪丸于冰上剪碎，迅速用編好號的錫箔紙分包成2份，置于液氮中，后轉移至-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.3 主要試劑 KISS-1抗體(免疫組化用KISS-1 抗體，MABC60，Millipore產(chǎn)品)；GPR54抗體(免疫組化用GPR54 抗體，GTX37417，GeneTex產(chǎn)品)；KISS-1抗體(WB用KISS-1抗體，ab19028，Abcam產(chǎn)品)；GPR54抗體(WB用GPR54抗體，bs-2501R，Bioss產(chǎn)品)；二抗(Goat Anti-Rabbit IgG H&L，ab6721，Abcam產(chǎn)品)；內參(GAPDH 抗體，ab8245，Abcam產(chǎn)品)。

1.4 免疫組化確定KISS-1/GPR54定位 制備睪丸組織石蠟切片后，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，下行至蒸餾水，進行抗原修復，羊血清工作液封閉后，滴加已稀釋好的一抗(KISS-1抗體稀釋比1∶500，GPR54抗體稀釋比1∶100)，4 ℃過夜，然后采用通用型二步法反應，滴加DAB顯色液，室溫避光作用2～10 min，經(jīng)0.1 mol/L pH 7.4 的PBS藍化作用15 min，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照(Olympus BX43)。

1.5 實時熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)測定KISS-1/GPR54基因表達 通過Primer-BLAST檢索出相應基因的引物序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按說明書步驟提取總RNA、合成cDNA，進行RT-qPCR試驗。

1.6 Western Blot測定KISS-1/GPR54蛋白表達 按說明書步驟進行總蛋白提取和Western Blot樣品制備。將樣品置于15孔預制膠中，連接電泳儀，將電壓調至140 V，時間為130 min，待Marker條帶分層至10 kDa分子量標記顯現(xiàn)時停止電泳。轉膜后一抗封閉，在4 ℃下?lián)u床過夜；第2天，二抗封閉，在4 ℃下?lián)u床封閉1 h。TBST清洗后，進行曝光，曝光液分A、B液，按1∶1比例現(xiàn)用現(xiàn)配，準備高敏、超敏2種發(fā)光液，分別進行曝光，結果以圖片形式進行保存。用成像系統(tǒng)(ChemiDocTM XRS+System,Bio-Rad)讀取條帶灰度值，以GAPDH作為內參，使用Image Lab進行相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(Mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)在進行分析前經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合標準后，采用重復測量方差分析對結果進行統(tǒng)計分析，取P<0.05 為具有統(tǒng)計學意義顯著差異，P<0.01為具有統(tǒng)計學意義極顯著差異。

2 結果

2.1 生長期大鼠體重、睪重、睪丸指數(shù)變化情況 在第21天、第35天、第43天、第56天4個時間點進行動態(tài)取材，各時間點大鼠體重、睪重、睪丸指數(shù)變化見表1。如表1所示，大鼠體重、睪重、睪丸指數(shù)在第21天至第35天階段均出現(xiàn)明顯增加(P<0.01)，其中體重、睪重均隨鼠齡增加而增加(P<0.05)。對于體重，大鼠的體重發(fā)育具有一定的階段性，本試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠在第21天至第35天處于第1個生長高峰，第35天至第43天大鼠體重增加速度放緩，第21天至第35天體重增長速度最快。大鼠的睪丸重量及睪丸指數(shù)可以體現(xiàn)大鼠的睪丸發(fā)育水平，本試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，隨著鼠齡的增加，大鼠的睪丸重量不斷增加，第21天至第35天是大鼠睪丸重量增長最快的階段，后逐漸放緩。大鼠睪重的變化趨勢與體重基本一致。而大鼠的睪丸指數(shù)并不一直增加，在經(jīng)過第21天至第35天的明顯增加后基本穩(wěn)定。

表1 生長期大鼠體重、睪重、睪丸指數(shù)變化情況Table 1 Changes of body weight,testis weight and testis index of growth period rats

2.2 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54蛋白表達定位情況 KISS-1/GPR54在生長期各階段大鼠睪丸的生精細胞和間質細胞均見表達，見中插彩版圖1。

2.3 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 mRNA表達情況 生長期各取樣點大鼠睪丸KISS-1/GPR54 mRNA表達情況如表2所示。對于KISS-1 mRNA表達情況，可以看出在第35天處明顯升高出現(xiàn)表達峰值(P<0.01)，隨后雖略有下降但第43天和第56天較第35天均無顯著性差異(P>0.05)。對于GPR54 mRNA表達情況，可以看出第21天至第35天 表達情況幾乎沒有變化，第35天至第43天表達上升(P<0.01)并在第43天出現(xiàn)峰值，隨后雖然在第43天至第56天出現(xiàn)下降，但第56天較第43天表達量無顯著性差異(P>0.05)。

表2 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR 54 mRNA表達情況Table 2 KISS-1/GPR 54 mRNA expression in the testis of growth period rats

2.4 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達情況 生長期各取樣點大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達情況如表3所示。隨著鼠齡的增加，大鼠睪丸中KISS-1蛋白表達逐漸增高且各時間點較前一時間點均有顯著性差異(P<0.05)，特別是在第21天至第35天和第43天至第56天2個階段出現(xiàn)非常顯著性差異(P<0.01)。隨著鼠齡的增加，大鼠睪丸GPR54表達也逐漸增加，第21天至第35天階段無明顯變化，第35天至第43天階段蛋白表達極明顯升高(P<0.01)，第43天至第56天階段基本不變。

表3 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達情況Table 3 KISS-1/GPR54 protein expression in the testis of growth period rats

3 討論

3.1 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達定位 對于不同種動物的睪丸中KISS-1/GPR54表達的定位問題研究結果不一，在對五指山豬[6]和黃牛[7]的研究中發(fā)現(xiàn)，在睪丸間質細胞、各階段的生精細胞中均發(fā)現(xiàn)KISS-1的表達，也有研究發(fā)現(xiàn)雄性大鼠睪丸的生精細胞中有KISS-1的表達，但在間質細胞中無表達。相關研究結果不一致影響進一步探究KISS-1/GPR54在睪丸中的生理功能。本試驗通過對于生長期大鼠睪丸進行動態(tài)取點研究發(fā)現(xiàn)，從第21天開始KISS-1/GPR54在大鼠的間質細胞和生精細胞中均見表達，且隨著青春期發(fā)育，在生精細胞的表達量增加。

許孟杰[8]對ICR小鼠的KISS-1/GPR54的蛋白表達定位進行了研究，發(fā)現(xiàn)針對ICR小鼠KISS-1僅分布于間質細胞，GPR54在精子細胞中特異性表達，而不是精原細胞、精母細胞或支持細胞。鑒于睪丸存在的“血睪屏障”結構，睪丸間質細胞所分泌的KISS-1無法與精子細胞中表達的GPR54結合產(chǎn)生作用，推測睪丸間質細胞所分泌的KISS-1另有功能。Anjum等[9]從出生到衰老各階段小鼠睪丸中KISS-1的表達定位進行研究，發(fā)現(xiàn)在出生時在精原細胞中發(fā)現(xiàn)KISS-1，隨著生長發(fā)育精原細胞中KISS-1免疫染色后顏色加深，睪丸間質細胞中顏色變淺，到青春期期間睪丸間質細胞中顏色變深，進入衰老期KISS-1主要集中在睪丸間質細胞表達。其他對于小鼠的研究也發(fā)現(xiàn)不同鼠齡特別是處于生殖周期的不同階段，KISS-1/GPR54表達定位結果不同。據(jù)此可以推斷，KISS-1/GPR54可能參與大鼠精子成熟和性激素分泌，但在生殖周期的不同階段KISS-1/GPR54在大鼠睪丸中的生理功能可能有所不同。

3.2 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 mRNA和蛋白的表達情況 本試驗采用動態(tài)取點的方法，取離乳期(第21天)、青春期前期(第35天)、青春期(第43天)、青春期后期(第56天)4個時間點進行研究發(fā)現(xiàn)，KISS-1/GPR54 mRNA在大鼠睪丸中均有表達，且呈現(xiàn)一定的時序性變化趨勢。就KISS-1 mRNA表達情況來看，從第21天至第35天這個時間段，大鼠睪丸中KISS-1 mRNA表達明顯增高，在第35天出現(xiàn)峰值，隨后略有降低但無顯著性差異。就GPR54 mRNA表達情況而言，第21天至第35天這個時間段GPR54表達基本穩(wěn)定，第35天至第43天時間段出現(xiàn)顯著性增加，第43天至第56天表達出現(xiàn)下降但無顯著性差異。對比可以發(fā)現(xiàn)，GPR54表達峰值的出現(xiàn)晚于KISS-1表達峰值?？赡苡捎贙ISS-1對于能量變化更為敏感有關，且GPR54為KISS-1的受體，當KISS-1表達增高并積累到一定程度時GPR54表達才出現(xiàn)增高。KISS-1/GPR54 蛋白在大鼠睪丸中均有表達，與mRNA的表達結果一致，但也表現(xiàn)出一定的時序性特點。就KISS-1蛋白表達情況來看，隨著鼠齡的增加，KISS-1蛋白表達逐漸增加，在第43天至第56天表達增加更加明顯，在第56天出現(xiàn)峰值。就GPR54蛋白表達情況來看，第21天至第35天GPR54蛋白表達基本保持不變，在第35天至第43天出現(xiàn)明顯的增加，第43天至第56天基本保持不變，在第56天出現(xiàn)峰值。綜上，KISS-1/GPR54在睪丸中表達蛋白峰值出現(xiàn)的時間點晚于mRNA峰值出現(xiàn)的時間點，且KISS-1峰值出現(xiàn)早于GPR54峰值的出現(xiàn)。

許孟杰[8]用細胞分離的方法研究發(fā)現(xiàn)，KISS-1 mRNA主要表達于睪丸間質細胞，GPR54 mRNA主要表達于生精小管細胞，而非睪丸間質細胞。曾泰祥[10]發(fā)現(xiàn)，對于12周齡的ICR小鼠KISS-1與GPR54都高度表達于睪丸的睪丸間質細胞中，由此推測，KISS-1可能分泌自睪丸間質細胞并作用于睪丸間質細胞本身而形成自分泌(Autocrine)路徑。此外，同樣的試驗對于4周齡未進入青春期的ICR小鼠，發(fā)現(xiàn)未進入青春期的ICR小鼠睪丸間質細胞的KISS-1和GPR54表達量顯著低于青春期后的小鼠。根據(jù)上述試驗結果，雖然KISS-1可能通過自分泌途徑直接作用于睪丸，但是KISS-1/GPR54系統(tǒng)在生殖功能調節(jié)中的確切生理作用仍有待闡明。

4 小結

本試驗表明，KISS-1/GPR54在生長期大鼠睪丸生精細胞和間質細胞均表達。大鼠睪丸中KISS-1/GPR54表達呈現(xiàn)一定的時序性，mRNA和蛋白表達趨勢基本一致，第21天至第56天整體上均呈現(xiàn)一定的表達上升的趨勢。據(jù)此推測在生殖周期的不同階段，大鼠睪丸中KISS-1/GPR54的生理功能可能有所不同。