劉帥 陳志恒 王慧 馬才啟 梁云浩 楊麗 姜煜 孫玲

卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)能有效解決輔助生育中因男性精子不佳造成的不育問(wèn)題。Nyboe等[1]多國(guó)家多中心的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，ICSI在輔助生育中的使用率已由原來(lái)的39.6%上升到58.9%。目前，有些國(guó)家ICSI的使用率甚至已經(jīng)達(dá)到了70%～80%[2]。雖然ICSI已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但妊娠結(jié)局仍不夠理想。精子作為重要的父源基因載體，可影響胚胎發(fā)育的質(zhì)量，從而影響最終的妊娠結(jié)局。許多男性不育均由基因缺陷所致，自然情況下射出精子的異常率高達(dá)50%～70%，精子經(jīng)過(guò)層層篩選，只有活率高、結(jié)構(gòu)正常的精子才能達(dá)到壺腹部，與卵母細(xì)胞結(jié)合，完成受精。ICSI規(guī)避了自然受孕中諸多篩選步驟，例如與生殖道篩選、卵冠丘篩選和卵透明帶篩選等，因此，ICSI的應(yīng)用可能會(huì)增加出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的ICSI精子優(yōu)選方法，大致可分為五類[3-4]：(1)基于精子膜電荷篩選；(2)剔除凋亡精子；(3)基于精子膜成熟度篩選；(4)精子形態(tài)學(xué)篩選；(5)精子功能篩選。本文著重對(duì)基于精子功能篩選為目的的透明帶結(jié)合法用于ICSI精子篩選(ICSI using zona pellucida-bound spermatozoa,ZP-ICSI)的最新應(yīng)用進(jìn)行綜述，并探討其原理、可行性、優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用效果。

一、ICSI精子優(yōu)選的必要性

在自然受孕過(guò)程中，有生育力的男性每次射出的精液中只有約14%(8%～25%)的活動(dòng)精子可以與透明帶結(jié)合，而低生育力男性人群，可以與透明帶結(jié)合的活動(dòng)精子甚至更少，平均為4.3%。此外，在與透明帶結(jié)合的精子中，只有48%會(huì)啟動(dòng)頂體反應(yīng)，可能會(huì)進(jìn)一步完成精卵融合[5]。不論自然受孕還是體外受精(IVF)，只有能與透明帶結(jié)合的精子才有機(jī)會(huì)穿透卵透明帶并完成受精。與ICSI相比，IVF具有相對(duì)高的胚胎發(fā)育率和妊娠結(jié)局，其中一個(gè)重要原因就是由于IVF會(huì)經(jīng)歷透明帶與精子結(jié)合的生物學(xué)篩選過(guò)程，而這一過(guò)程在ICSI中被省略了。

傳統(tǒng)的精子質(zhì)量評(píng)價(jià)方式主要關(guān)注精子的形態(tài)和活率，上游法和密度梯度離心法是目前輔助生殖中常用的精子優(yōu)選方法。這兩種方法分別基于精子遷移和精子沉淀作用來(lái)篩選精子。然而，上游和密度梯度離心法無(wú)法滿足精子其他特質(zhì)的篩選，如精子DNA完整性、精子膜的成熟度、精子凋亡和精子超微結(jié)構(gòu)等，而精子這些特質(zhì)的缺陷往往是導(dǎo)致不育的關(guān)鍵因素。因此，目前很多研究把關(guān)注點(diǎn)放在精子成熟度和功能上，從提高輔助生殖的安全性和成功率出發(fā)，尋找更好的精子優(yōu)選方法。其中ZP-ICSI是采用失去受精潛能的不成熟卵子去篩選高質(zhì)量的精子，盡可能模擬自然選擇的過(guò)程，彌補(bǔ)常規(guī)ICSI技術(shù)繞過(guò)頂體反應(yīng)、精卵結(jié)合等自然受精生理過(guò)程的短板，以期提高ICSI的成功率。

二、ZP蛋白在受精中的作用

在生理?xiàng)l件下，透明帶對(duì)物種間精卵識(shí)別及精子與頂體反應(yīng)誘發(fā)起著重要的作用。ZP的表面存在大量糖基化蛋白，其多肽鏈上以N-連接或O-連接共價(jià)結(jié)合許多寡糖鏈和單糖鏈側(cè)枝，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺等，其中分布最為豐富的是sialyl-LewisX鏈，即[NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]序列，并且其在初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞ZP中已穩(wěn)定存在[6]。其功能是通過(guò)ZP糖蛋白中的寡糖和精子表面蛋白質(zhì)相互作用，實(shí)現(xiàn)精卵識(shí)別并誘發(fā)頂體反應(yīng)。人類精子與sialyl-LewisX或牛血清蛋白孵育后，精子與ZP的結(jié)合能力會(huì)大幅度下降。此外，sialyl-LewisX抗體可抑制半透明帶結(jié)合實(shí)驗(yàn)中精卵結(jié)合的能力[7]。

Ganguly等[8]通過(guò)標(biāo)記FITC研究重組人透明帶糖蛋白(recombinant human zona pellucida,rhZP)與精卵結(jié)合及誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，人類4種ZP糖蛋白均參與精卵結(jié)合，除了ZP2外，其余3種透明帶糖蛋白均參與了頂體反應(yīng)誘發(fā)。大腸埃希菌和桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)的rhZP1能與獲能的精子頭部前區(qū)結(jié)合，但不能與已完成頂體反應(yīng)的精子結(jié)合。來(lái)自桿狀病毒系統(tǒng)rhZP1能劑量性地誘發(fā)頂體反應(yīng)，而來(lái)自大腸埃希菌rhZP1不能，提示ZP1在頂體反應(yīng)中重要作用，其中人類ZP1中273～551 aa片段誘導(dǎo)頂體反應(yīng)最強(qiáng)。來(lái)自原核和桿狀病毒系統(tǒng)的rhZP2均能與已完成頂體反應(yīng)的精子赤道區(qū)結(jié)合，但不與獲能精子結(jié)合，說(shuō)明ZP2在受精過(guò)程中是精子的次級(jí)受體。來(lái)自桿狀病毒系統(tǒng)的rhZP3和rhZP4均能與獲能精子的頭部或赤道區(qū)域結(jié)合，但不能與已完成頂體反應(yīng)的精子結(jié)合，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了ZP3和ZP4為人類精子的初級(jí)受體[9]?？紤]到重組DNA 技術(shù)獲取的rhZP與天然人類透明帶糖蛋白的差異，Chiu等[10-11]進(jìn)行了純化hZP蛋白功能性研究，結(jié)論基本一致。

三、ZP-ICSI在精子優(yōu)選中的作用

1. 對(duì)精子蛋白的篩選：通常認(rèn)為早期胚胎發(fā)育主要由卵子因素所調(diào)控，但現(xiàn)在研究證實(shí)，精子的基因在受精和卵裂初期，不是完全沉默的，而精子與透明帶結(jié)合的能力，也是一種父源性對(duì)胚胎早期發(fā)育正向影響的機(jī)制[12]。精子與透明帶的結(jié)合，可激活頂體的胞吐作用，暴露精子表面與卵母細(xì)胞特異性結(jié)合的位點(diǎn)。精卵相互作用所涉及的精子蛋白，如PH20、α-D-甘露糖苷酶、甘露糖結(jié)合蛋白、FA-1、選擇素分子、α-巖藻糖苷酶、α1-3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶及hCRISP1等，與男性不育以及輔助生育結(jié)局是密切相關(guān)的[13-15]。良好的精子蛋白功能是精卵結(jié)合的前提，例如人類精子神經(jīng)氨酸酶可消耗ZP的唾液酸殘基，從而暴露ZP上的精子結(jié)合位點(diǎn)。倘若采用溫和化學(xué)方法消耗人ZP唾液酸殘基，精子-ZP結(jié)合反應(yīng)減弱30%，但采用神經(jīng)氨酸酶去除人ZP的唾液酸殘基，精子-ZP結(jié)合反應(yīng)卻增強(qiáng)3倍[16]。雖然有諸多的精子受體被證實(shí)為ZP結(jié)合的特異蛋白，但單獨(dú)的敲除某個(gè)單獨(dú)特異蛋白基因，小鼠依然可以受孕[17]。由此可見(jiàn)，某個(gè)精子表面蛋白不能單獨(dú)介導(dǎo)精子和透明帶的相互作用，而是多個(gè)受體-配體相互配合的結(jié)果[10]。ZP-ICSI可對(duì)這些受體的表達(dá)水平進(jìn)行一個(gè)綜合性的篩選。

2.受精成功與否的敏感指標(biāo)：精卵結(jié)合能力是受精成功與否的敏感指標(biāo)，若存在缺陷是受精率低的主要原因。Liu等[18]收集IVF中獲卵數(shù)≥3枚的病例，評(píng)估其精卵結(jié)合及融合能力。根據(jù)受精率將研究對(duì)象分為4組，即0%(n=369)、1%～25%(n=194)、26%～50%(n=81)、51%～95%(n=100)。受精率為0%研究組與受精率為51%～95%研究組的畸形精子率分別為36%及7%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與此同時(shí)，受精率為0%的研究組中，70%的病例只有≤5條的活動(dòng)精子與透明帶結(jié)合。為了確定精卵結(jié)合存在缺陷，主要是卵子造成的還是精子造成的，在受精率為0%的研究組中，選取68位患者，每人隨機(jī)選擇4～5枚受精失敗后的卵子，將其與有生育力的捐贈(zèng)精液孵育2 h，結(jié)果顯示，每枚重孵育后的卵子表面精子數(shù)為(96±12)條。由此可見(jiàn)，精卵間相互作用缺陷的原因，與卵子缺陷因素相比，更多是精子缺陷占主導(dǎo)因素。

3. 降低畸形精子率：精子與透明帶結(jié)合能力，與精液濃度以及精子正常的形態(tài)學(xué)密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，精子缺乏癥的患者，通常精卵間的相互作用能力就差[19]。而正常生育力的男性(已育)人群，精液濃度>60×106/ ml組與≤60×106/ ml組的透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)率分別為(50±23)%、(37±15)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與之相類似的，正常精子形態(tài)率≥15%組與<15%組的透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)率分別為(52±22)%、(40±20)%，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[20]。人類透明帶選擇性的與形態(tài)正常的精子結(jié)合，尤其是頂體大小合適且形態(tài)好的精子具有結(jié)合優(yōu)勢(shì)。Garrett等[21]研究證實(shí)，頭部前區(qū)較大、光密度較低的精子和頸部異常較小、軸線高度對(duì)稱的精子，更易與透明帶結(jié)合。形態(tài)異常的精子，例如圓頭精子沒(méi)有頂體，就沒(méi)有能力與透明帶結(jié)合。

4. 頂體的去除：透明帶結(jié)合法用于ICSI精子篩選有一個(gè)優(yōu)勢(shì)，當(dāng)精子與透明帶結(jié)合后，會(huì)引起頂體反應(yīng)，頂體的內(nèi)含物通過(guò)胞吐作用得到釋放，減少了頂體的水解酶進(jìn)入卵細(xì)胞，降低了毒性。ICSI技術(shù)可以應(yīng)用在小鼠和人類上并獲得正常的后代，而這種技術(shù)在其他物種里鮮有成功。事實(shí)上是由于小鼠和人類的頂體較小，雖然ICSI時(shí)會(huì)帶入包含強(qiáng)大水解酶的頂體，但不會(huì)影響到卵母細(xì)胞[22]。與之相比，倉(cāng)鼠就不行，由于該物種的頂體巨大，ICSI勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞的死亡。此外，多項(xiàng)臨床研究證明，ZP誘發(fā)的頂體反應(yīng)可作為輔助生育治療中預(yù)測(cè)受精成功與否的敏感指標(biāo)[20,23]。

5. DNA的完整性：輔助生育臨床工作中，嚴(yán)重少精癥、弱精子癥、尤其是畸型精子癥會(huì)影響精卵結(jié)合相互作用[24]。但是更多的患者的情況是常規(guī)精液檢查正常，由于諸如精子DNA損傷等因素導(dǎo)致的微小缺陷，從而ICSI反復(fù)失敗。卵母細(xì)胞能起到修復(fù)精子DNA的作用，父源性的DNA損傷可以經(jīng)過(guò)卵母細(xì)胞的系統(tǒng)修復(fù)后，同樣也可以受精，胚胎進(jìn)一步發(fā)育，甚至受孕成功。但如果一份精液中精子DNA損傷有較高比例，不單影響與透明帶結(jié)合的能力，還可影響受精率、胚胎發(fā)育、妊娠率及子代的健康[25]。學(xué)者們?cè)噲D通過(guò)ZP-ICSI篩選出DNA完整的精子，應(yīng)用吖啶橙熒光法可觀察到，大多數(shù)能與透明帶結(jié)合的精子(>90%)含有正常的DNA[26]。

四、ZP-ICSI的可行性

用于精子功能測(cè)試或ZP-ICSI研究的透明帶來(lái)源可以是臨床IVF病例中受精失敗的卵子。未受精的卵子72～86 h內(nèi)，仍具有與精子結(jié)合以及誘發(fā)頂體反應(yīng)的功能。臨床IVF實(shí)驗(yàn)中20%～30%的卵子通常會(huì)受精失敗，然后被丟棄。而這部分卵子，經(jīng)倫理委員會(huì)允許，且充分知情告知患者的情況下，95%的患者依從性很高，愿意將其進(jìn)行研究或精子功能測(cè)試[18]。而ZP-ICSI臨床應(yīng)用時(shí)，透明帶來(lái)源則通常是不成熟卵子。由于不能正常受精，不成熟卵子通常不會(huì)用來(lái)做ICSI。未成熟卵子和成熟卵子一樣，具有與正常形態(tài)和完整DNA精子結(jié)合的生物學(xué)功能。因此，透明帶結(jié)合實(shí)驗(yàn)可以采用同一周期收集的未成熟卵子[25]。如果全部為成熟卵子(≥6個(gè))，可選用其中的一個(gè)做透明帶結(jié)合實(shí)驗(yàn)?；顒?dòng)精子的選擇通常采用上游法或密度梯度離心法，將1×106～2×106條活動(dòng)精子與卵子一起共培養(yǎng)2 h。正常生育力的男性，通常每個(gè)卵子平均有上百條的精子可結(jié)合在透明帶上。精卵共同孵育后，將與透明帶結(jié)合的精子重新回收，用于ICSI以期獲得更好的臨床結(jié)局。精子透明帶結(jié)合實(shí)驗(yàn)很簡(jiǎn)單，經(jīng)過(guò)短時(shí)間培訓(xùn)大多數(shù)胚胎學(xué)家都可以操作。但是有些特殊情況，并不適合ICSI前應(yīng)用透明帶結(jié)合法篩選精子。比如說(shuō)有些病人，精子濃度、活力、正常形態(tài)率差或者整體精液質(zhì)量十分差，或者精子是從附睪或睪丸獲取的，像這樣的情形，只能采用常規(guī)的精子篩選法[27]。

五、ZP-ICSI對(duì)妊娠結(jié)局的影響

ICSI技術(shù)為男性不育的治療帶來(lái)了革命性的推進(jìn)。盡管現(xiàn)在ICSI的受精率還可以，但其胚胎的質(zhì)量和植入率仍不夠理想。許多學(xué)者不斷探究采用ZP-ICSI是否可以提高受精率、優(yōu)胚率、改善妊娠結(jié)局(表1)。最初將透明帶結(jié)合法用于ICSI精子篩選的是Paes[22]團(tuán)隊(duì)。該團(tuán)隊(duì)探討透明帶結(jié)合法用于ICSI精子篩選是否可以提高受精率和獲得更好的胚胎質(zhì)量。該研究對(duì)象為40對(duì)接受ICSI治療的夫婦，收集其治療周期中不成熟卵子。研究組采用透明帶結(jié)合法篩選精子，而對(duì)照組采用常規(guī)篩選的精子進(jìn)行ICSI。研究顯示，透明帶結(jié)合篩選組與對(duì)照組的受精率分別為77.3%、76.8%，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而優(yōu)胚率分別為83.3%、70.0%，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。Black等[28]做了類似的研究，結(jié)果顯示，透明帶結(jié)合篩選組與對(duì)照組在受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、種植率及妊娠率上差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但研究組與對(duì)照組相比，新鮮周期的種植率和臨床妊娠率還是有所提高。Liu等[29]的研究結(jié)果驗(yàn)證了Paes團(tuán)隊(duì)的結(jié)論，透明帶結(jié)合篩選組雖然受精率變化不大，但是可以顯著提高優(yōu)胚率及種植率。Casciani等[30]的實(shí)驗(yàn)小組研究結(jié)論和Black等的基本一致，雖然差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是透明帶結(jié)合篩選組抱嬰率[Casciani：33.3% vs Black：31.6%]還是有所提高。與此同時(shí)，還觀察到透明帶精子結(jié)合效果與好的精子形態(tài)及濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)。金銳等[31]和Jin等[32]來(lái)自不同的兩個(gè)團(tuán)隊(duì)，其研究數(shù)據(jù)均再次顯示，透明帶結(jié)合篩選組的優(yōu)胚率及可利用胚胎率，與對(duì)照組相比，有顯著性提高。

六、小結(jié)與展望

綜上所述，由于卵母細(xì)胞資源有限，優(yōu)選精子是改善ICSI技術(shù)的突破口之一。優(yōu)選精子的關(guān)注點(diǎn)不僅要考慮精子的活力和形態(tài)，更應(yīng)把是否篩選掉遺傳物質(zhì)異常的精子作為精子評(píng)估的重點(diǎn)。未來(lái)急需尋求一種簡(jiǎn)單、客觀、高效和安全的精子優(yōu)選方法，以期改善輔助生殖技術(shù)患者的臨床結(jié)局。ZP-ICSI作為一種模擬生理狀態(tài)來(lái)篩選正常的精子的方法，可以改善ICSI的妊娠結(jié)局，尤其適用常規(guī)ICSI反復(fù)失敗、受精率低、精子嚴(yán)重畸形或DNA損傷的病例。該技術(shù)若要進(jìn)行大規(guī)模的臨床應(yīng)用，仍需要進(jìn)一步積累臨床數(shù)據(jù)，嚴(yán)格評(píng)估其效果與可靠性。

表1 ZP-ICSI組與常規(guī)ICSI組的臨床結(jié)局比較總結(jié)

作者(年份)研究組(例)對(duì)照組(例)可利用率(%)研究組對(duì)照組種植率(%)研究組對(duì)照組妊娠率(%)研究組對(duì)照組Paes等(2009)[22]4040——————Black等(2010)[28]3939——22.416.9☆41.729.0☆Liu等(2011)[29]5353——29.0?17.0☆49.036.0☆金銳等(2013)[31]272776.0?66.3——59.348.2Casciani等(2014)[30]6038——17.419.641.742.1Jin等(2016)[32]384276.0?66.339.3?23.160.547.6

注:*P<0.05;☆新鮮胚胎移植周期