喬東亞 王鵬 王淑安 張恩亮 高露璐 李亞 楊如同

摘要：以紫薇品種金幌和粉晶為材料，對其由低光照[50～120 μmol/（m2·s）]轉向高光照[1 200～2 000 μmol/（m2·s）]后168 h內(nèi)葉片葉綠素含量、光合特性、葉綠素熒光參數(shù)、葉綠素合成前體物質含量及過氧化物酶活性等進行了測定和分析。結果表明：（1）與低光照相比，高光照處理168 h后，金幌葉片中葉綠素a、葉綠素b含量、超氧化物歧化酶活性、凈光合速率和蒸騰速率顯著低于粉晶。（2）在低光照時，金幌葉片中的5-氨基乙酰丙酸、膽色素、尿卟啉和糞卟啉等4種前體物質含量均顯著高于粉晶，其中糞卟啉含量是粉晶中的2倍。（3）高光照處理168 h后，金幌葉片中非光化學猝滅（NPQ）參數(shù)值顯著高于粉晶，而PSⅡ原初光化學效率（Fv/Fm）和非循環(huán)光合電子傳遞速率（ETR）則與粉晶差異不顯著。說明金幌葉色變化的直接原因是葉綠素含量，特別是葉綠素b含量變化。葉綠素b含量的改變則是由于葉綠素合成前體物質，特別是糞卟啉的累積造成的。葉綠素含量的改變同時導致了金幌光合能力的降低及光合系統(tǒng)PS II的穩(wěn)定性的改變。

關鍵詞：紫薇;葉色;光響應;葉綠體

中圖分類號：S685.99文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）01-0180-07

Abstract：In this study， the acclimation response of crape myrtle （Lagerstroemia indica） Jinhuang and Fenjing plants was assessed during 168 h after transferring from low light [LL， 50-120 μmol/（m2·s）] to high light [HL， 1 200-2 000 μmol/（m2·s）] by analyzing the content of chlorophyll， photosynthetic properties， chlorophyll fluorescence parameters， chlorophyll synthesis precursors contents and peroxidase activity. The results showed that compared with low light treatment， the contents of chlorophyll a and chlorophyll b， superoxide dismutase activity， net photosynthetic rate and transpiration rate of leaves in Jinhuang were significantly lower than those in Fenjing after 168 hours of high light treatment. Under low light conditions， the contents of four precursors including 5-aminolevulinic acid， bile pigment， urinary porphyrin and coproporphyrin in Jinhuang leaves were significantly higher than those in Fenjing， and the content of coproporphyrin was twice as high as that in Fenjing. After 168 hours of high light treatment， the value of non-photochemical quenching （NPQ） in Jinhuang leaves was significantly higher than that in Fenjing， while the differences of initial light energy conversion efficiency of PS II（Fv/Fm） and electron transport rate（ETR） were not significant. This indicates that the change of leaf color in Jinhuang is directly caused by the change of chlorophyll content， especially the content of chlorophyll b. The change of chlorophyll b content is caused by the accumulation of chlorophyll synthesis precursors， especially coprophyrin. The changes of chlorophyll content also lead to the decrease of photosynthetic capacity and PS II stability in Jinhuang.

Key words：Lagerstroemia indica;leaf color;photoresponse;chloroplast

紫薇（Lagerstroemia indica），千屈菜科（Lythraceae）紫薇屬（Lagerstroemia）植物，具有花期長、花色豐富等特點，素有“滿堂紅”、“百日紅”之稱，為中國乃至世界上重要的夏季觀花植物。紫薇金葉品種金幌是由紫薇品種粉晶的金色芽變培育的彩葉紫薇品種，與傳統(tǒng)觀花紫薇相比，其葉色金黃，獨具特點，具有較高的觀賞價值[1]。通過前期對葉色變異機理的研究，發(fā)現(xiàn)金幌葉色變異與光照度有關[2]，但是關于其對高光照響應的生理機制還不清楚。

葉色突變體的表型與葉片中細胞色素的類型和各種色素的含量以及它們之間的比例有關，同時光照時間及強度等環(huán)境因素也影響其表型。不同光照度處理下，金葉與正常葉的葉綠素含量有差異[3-5]。金邊大葉黃楊（Euonymus japonicus Ovatus Aureus）在低光照度條件下生長時葉片葉綠素含量顯著高于全光條件下[6]。隨著光照度的增加，中華金葉榆葉片葉綠素含量發(fā)生很大變化，類胡蘿卜素、葉綠素及花色素苷含量間的比值最終影響中華金葉榆葉片顏色的表達。

高光照下，葉色黃化突變體很容易出現(xiàn)灼傷現(xiàn)象。玉簪的黃化品種（Hosta Golden Edger）和花葉品種（Hosta Antioch）等在光照過強時，會出現(xiàn)不同程度的焦邊、灼傷，甚至地上部枯死等現(xiàn)象[7-8]。非光化學猝滅系數(shù)越高的雞爪槭品種日灼現(xiàn)象越嚴重，實際光化學效率和電子傳遞速率（ETR）與日灼抗性間關系密切，易受日灼傷害的品種有較低的實際光化學效率和ETR值[9]。

本研究以紫薇金葉品種金幌和綠葉品種粉晶為材料，測定2個品種由低光照轉向高光照后不同時間葉片中葉綠素含量、葉綠素合成前體物質含量、光合參數(shù)、葉綠素熒光參數(shù)及過氧化物酶活性等指標，以期解析金幌葉色變化響應高光照的生理特征。

1材料與方法

1.1試驗材料

紫薇金葉品種金幌及對照品種粉晶的2年生扦插苗各40株定植于江蘇省中國科學院植物研究所紫薇種質資源圃，植株健壯，株距50 cm×50 cm，正常水肥管理。7月初，金幌及粉晶單株在光照度50～120 μmol/（m2·s）低光照（遮蔭）下處理20 d，然后在高光照（1 200～2 000 μmol/（m2·s））下處理7 d。

1.2葉片色素含量測定

選取金幌和粉晶當年生枝條第3～4節(jié)部成熟葉片，混合取樣，測定色素含量[9]。稱取0.10 g 葉片放入10 ml 試管中，加入10 ml 95%的乙醇，封口后閉光放置48 h，直到葉片完全變?yōu)榘咨Ｈ缓笥梅止夤舛扔嫓y定樣品OD 值，3次重復。取樣時間為高光照處理第0 d、2 d、4 d和7 d。

1.3光合特性相關指標的測定

選取當年生枝條第3～4 節(jié)部成熟葉片，在外界光照度1 200～2 000 μmol/（m2·s）、葉室光照度1 200 μmol/（m2·s）、氣溫28 ℃條件下，使用LI-6400 便攜式光合儀測定凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率等光合參數(shù)。測定時間為高光照處理第0 d、2 d、4 d和7 d的上午10∶00-11∶00，6次重復。

1.4葉片葉綠素熒光參數(shù)的測定

參考Brian等[10]的方法，利用OS-5P+便攜式脈沖調(diào)制葉綠素熒光儀，在自然光照條件下測定當年生無病蟲害枝條第3～4 節(jié)部成熟葉片的PSⅡ原初光化學效率（Fv/Fm）、非循環(huán)光合電子傳遞速率（ETR）和非光化學猝滅（NPQ）等參數(shù)。測定時間為高光照處理第0 h、2 h、4 h和7 h，6次重復。

1.5葉綠素合成前體物質含量測定

取當年生第3～4 節(jié)部成熟葉片1.00 g，去掉主脈，剪碎。 氨基乙酰丙酸（ALA）含量的測定與膽色素原（PBG）含量的測定參照Bogorad[11]的方法。參照 Bogorad [11]的方法，在Perkin Elmer Ls熒光分光光度計上測定E400F633、E400F622和E400 F640，計算原卟啉（ProtoIX）的含量;測定E420F678，計算鎂原卟啉（Mg-ProtoIX）含量;測定E440F640、E400F633，計算原葉綠素酯（Pchlide）含量。樣品采集時間為高光照處理第0 h、2 h、4 h和7 h ，3次重復。

1.6過氧化物酶活性測定

在高光照處理第0、2、4和7 d的上午10∶00-11∶00 時，選取當年生無病蟲害枝條第3～4節(jié)部成熟葉片，混合取樣，測定過氧化物酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）活性利用總超氧化物歧化酶測定試劑盒（A001-3，南京建成生物科技有限公司產(chǎn)品）測定，過氧化氫酶（CAT）活性利用過氧化氫酶試劑盒（A007-1，南京建成生物科技有限公司產(chǎn)品）測定，過氧化物酶（POD）活性利用過氧化物酶試劑盒（A804-3，南京建成生物科技有限公司產(chǎn)品）測定，3次重復。

1.7數(shù)據(jù)處理

圖片數(shù)據(jù)使用Adobe Photoshop CS6（Adobe Inc.， California， USA）進行處理。采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理、作圖，用SPSS 22.0（SPSS Inc.， Chicago， USA）進行方差分析，LSD法進行多重比較，所測數(shù)據(jù)以平均值±標準差（SE）表示。

2結果與分析

2.1光照度增加導致紫薇金幌葉綠素b含量的降低及類病斑的形成

在低光照處理結束時（高光照0 h）時，金幌葉色淡黃，粉晶葉色黃綠，高光照處理168 h后，金幌葉片葉肉部分出現(xiàn)白化現(xiàn)象，黃色部分顏色變淺，粉晶恢復綠色（圖1A、圖1D）。為了闡明葉色變化原因，我們測定了金幌和粉晶的色素含量變化（圖2）。金幌和粉晶在低光照處理20 d后，僅葉綠素a含量在兩者葉片中有顯著差異。高光照處理48 h后，粉晶葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均高于金幌，并且葉綠素a含量在兩者之間有顯著差異。高光照處理96 h后，金幌葉片中葉綠素a/葉綠素b顯著高于粉晶，并且葉綠素a、葉綠素b含量顯著低于粉晶。高光照處理168 h后，金幌葉片中葉綠素a、葉綠素b含量顯著低于粉晶，類胡蘿卜素含量和葉綠素a/葉綠素b均高于粉晶;粉晶葉片中葉綠素a、類胡蘿卜素含量均增加，葉綠素b含量保持穩(wěn)定。但金幌葉片中葉綠素a、葉綠素b含量下降幅度較大，僅類胡蘿卜素含量有所增加。根據(jù)以上結果可以確定光照度引起金幌葉色變化的主要原因是葉綠素含量的變化。

葉綠素合成是從5-ALA開始的連續(xù)的生化過程，該過程大約需要15種酶參與，產(chǎn)生相應的中間產(chǎn)物，闡明中間產(chǎn)物的合成變化對解釋葉綠素b含量的變化具有重要意義。葉綠素合成的中間產(chǎn)物（前體物質）含量測定結果（表1）顯示，高光照0 h時，金幌葉片中ALA、PBG、尿卟啉（UrogenIII）和糞卟啉（CoprogenIII）含量均高于粉晶，且CoprogenIII是累積量最高的前體物質，是粉晶葉片中CoprogenIII含量的2倍，而ProtoIX、Mg-ProtoIX及原葉綠素酯（Pchl）含量則相反。說明金幌葉綠素合成過程中在CoprogenIII到ProtoIX處合成受阻。

高光照處理48 h時，金幌葉片出現(xiàn)紅色至棕色的類病斑，然后面積逐漸增大，至168 h時達到最大（圖1）。粉晶在高光照處理48 h時出現(xiàn)類病斑，然后類病斑面積在高光照處理96 h時達到最大，之后開始逐漸降低。類病斑的形成說明葉片受到光傷害，而光傷害與植物體內(nèi)的ROS（活性氧簇）途徑異常有關。SOD、POD和CAT是ROS途徑3個重要的酶。金幌葉片中，SOD活性隨著光照時間的增加而逐漸降低;CAT活性先增加到最大值（高光照48 h），然后逐漸降低，并且其活性一直高于對照粉晶葉片CAT活性，但是低光（高光照0 h）時則相反;POD活性先降低至最低值（高光照48 h）然后逐漸恢復到初始水平（高光照0 h和168 h差異不顯著），并且其活性一直高于對照粉晶葉片POD活性，但是高光照48 h時相反（圖3）。高光照處理168 h后，金幌葉片中SOD、CAT及POD活性分別是對照粉晶葉片中酶活性的0.87倍、1.34倍和1.94倍。 這些結果表明金幌葉片中的光傷害高于對照粉晶。

2.2光照度對紫薇金幌光合能力的影響

圖4顯示，高光照0 h和48 h時，光合參數(shù)在金幌和粉晶2個品種間均無顯著差異;高光照96 h和168 h時，光合速率、氣孔導度及蒸騰速率在2個品種間表現(xiàn)出顯著差異，而胞間二氧化碳濃度在2個品種之間仍無顯著差異。隨著高光照處理時間的增加，金幌的凈光合速率先升高后降低，而粉晶的凈光合速率逐漸升高;粉晶的氣孔導度先升高后持續(xù)降低，而金幌的氣孔導度呈上升趨勢;金幌和粉晶的胞間二氧化碳濃度均隨光照處理時間的增加而增大;金幌的蒸騰速率開始時增加，但48 h后迅速降低，而粉晶的蒸騰速率呈上升趨勢，但96 h的蒸騰速率與168 h時差異不顯著，說明粉晶的蒸騰作用趨于穩(wěn)定。隨著高光照處理時間的增加，金幌氣孔導度持續(xù)下降，隨之蒸騰速率下降，同時凈光合速率持續(xù)降低，而胞間二氧化碳濃度隨之升高，說明金幌的光合同化能力在減弱。

2.3高光照處理對紫薇金幌光合系統(tǒng)II的傷害

高光照0 h時，F(xiàn)v/Fm值在金幌和粉晶間不存在顯著差異（表2）。隨著高光照時間的增加，金幌葉片的Fv/Fm值逐漸降低，而粉晶葉片的Fv/Fm值先降低后趨于穩(wěn)定。這些結果表明金幌和粉晶的PSII在高光照下均受到損傷，但是金幌的損傷更為嚴重。

高光照0 h時，金幌的ETR值顯著高于粉晶。隨著高光照時間的增加，金幌葉片的ETR值逐漸降低，而粉晶葉片ETR值先降低后逐漸恢復。高光照處理4 h后，金幌的ETR值降低了34.58%。ETR呈下降趨勢，說明電子傳遞效率下降，可能有2方面原因，一是單位時間內(nèi)電子產(chǎn)率下降，二是電子轉運系統(tǒng)受損。這些結果也表明金幌PS II受到的傷害程度較重。隨著高光照處理時間的延長，PS II沒有得到恢復。

高光照0 h時，NPQ值在金幌和粉晶間不存在顯著差異。隨著高光照時間的增加，相較于粉晶，金幌中NPQ值呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，并在高光照7 h時達到最大。NPQ值升高，說明金幌捕光色素轉化的光能以熱耗散的形式散失的部分增加，金幌受到的光脅迫較粉晶嚴重。

以上結果顯示，在高光照處理中，金幌受到的光脅迫較粉晶嚴重，導致PS II受到的傷害程度較重。

3討論

3.1紫薇金葉品種金幌葉色變化可能與CPO活性的降低有關

葉綠素代謝是一個高度協(xié)調(diào)的酶促反應過程，需要一系列的酶參與。高等植物體內(nèi)葉綠素合成過程中任何一個環(huán)節(jié)異常，都可能致使葉綠素含量發(fā)生改變，進而引起葉片顏色的變異。在葉綠素合成通路中，Coprogen III 轉化成為Proto IX需要糞卟啉原氧化酶（CPO）的催化。Coprogen III為光敏化合物，其水平的降低可導致煙草（Nicotiana tabacum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）等植物出現(xiàn)光依賴型葉片黃化[12-15]。在擬南芥CPO缺失突變體lin2（A. thaliana lin2）中，幼葉淡綠色，中部有病斑，病斑起初較小或條紋狀[13]。紫薇金幌葉片在高光照條件下，葉片出現(xiàn)白斑并逐漸擴張。在抑制CPO表達的轉基因植物中發(fā)現(xiàn)隨著葉片病斑的擴大，抗氧化物酶的活性逐漸增加[12]。本研究中，高光照處理金幌葉片時也出現(xiàn)了lin2類似的表型。高光照處理7 d后，金幌葉片中SOD、CAT和POD等3個酶的活性分別是對照粉晶葉片中酶活性的0.87倍、1.34倍和1.94倍，與Kruse等[12]研究結果類似。

在水稻的一個PROB缺失突變體fgl中，ALA、Proto IX和Mg-ProtoIX等3個葉綠素合成前體物質含量在高光照下急劇下降[16]。在玉米的一個UROD缺失突變體Les22中，在高光照下尿卟啉含量較野生型增加了2～3倍，而Coprogen III含量未受到影響[17]。煙草中RNA干擾CPO表達可導致Coprogen III的積累[12]。本研究中，高光照0 h時，金幌葉片中ALA、PBG、UrogenIII和CoprogenIII含量均高于粉晶，且CoprogenIII是累積量最高的前體物質，是粉晶葉片中含量的2倍，而ProtoIX、Mg-ProtoIX及Pchl含量則相反。這些結果表明金幌葉綠素合成過程中在CoprogenIII到ProtoIX處合成受阻。紫薇金葉品種金幌的總葉綠素含量顯著低于粉晶，而葉綠素a和葉綠素b在高光照處理7 d后分別下降了47.89% 和70.26%，葉綠素b的減少更為顯著。

總之，本研究中通過對金幌和粉晶在低光照和高光照條件下葉片中抗氧化物酶活性、葉綠素及前體物質含量的測定，發(fā)現(xiàn)紫薇金葉品種金幌葉色變異是由于Coprogen III積累導致的。

3.2高光照處理對紫薇金幌PS II功能的影響

葉綠素缺失突變體為高等植物光合作用的研究提供了一個有力的工具[17]。葉綠素熒光參數(shù)是光合效率的重要指標，能夠反映光合系統(tǒng)內(nèi)部的調(diào)節(jié)過程，其動態(tài)變化蘊藏豐富的光合及生理信息。初始熒光（Fo）參數(shù)的改變反映了植物葉綠體中類囊體膜結構的變化，最大熒光（Fm）參數(shù)的大小反映了電子傳遞的最大潛力，可變熒光（Fv）參數(shù)反映了質體醌A （QA）的還原情況[18]。在水稻突變體vyl中，由于葉綠素少于野生型，ETR和NPQ值顯著低于野生型，而Fv/Fm在兩者間不存在顯著差異[19]。玉米的一個黃綠葉突變體中，在生育期的各個階段，其ETR、NPQ和Fv/Fm均低于野生型[20]。在本研究中，金幌的Fv/Fm值在低光照狀態(tài)下均大于粉晶，高光照處理后顯著減小，而Fv/Fm在粉晶中則是先減小后增大。在高光照處理7 h后金幌的Fv/Fm與對照粉晶相比，減少了53.75%。這一結果說明粉晶光系統(tǒng)II在最初受到了傷害，但之后逐漸恢復正常，而金幌受到傷害后沒有得到恢復。

金幌的NPQ較高，說明其葉片接收的光能主要通過熱耗散的方式消耗。低光照條件下，金幌的ETR高于粉晶;高光照處理后，金幌的ETR迅速降低，之后基本保持穩(wěn)定，而粉晶的ETR先是急劇降低，而后恢復至正常水平。高光照處理7 h后，金幌的ETR比粉晶減少34.58%。ETR的變化表明，金幌在高光照下電子傳遞系統(tǒng)受到破壞，且沒有得到恢復，而粉晶在突然暴露于高光照下時電子傳遞系統(tǒng)受到破壞，但光適應后迅速得到恢復。

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（責任編輯：張震林）