徐珮珮，楊明亮，劉長彬，李雅靜，劉梓桐，李建軍

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市 100068；2.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院脊柱脊髓神經(jīng)功能重建科，北京市 100068；3.北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷與修復(fù)研究所，北京市 100068；4.北京市神經(jīng)損傷與康復(fù)重點實驗室，北京市 100068；5.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京市 100070

腸道功能障礙是脊髓損傷后較為常見的并發(fā)癥，會引起腹脹、腹痛和頑固性便秘等癥狀。據(jù)統(tǒng)計，近半數(shù)脊髓損傷患者存在嚴(yán)重便秘問題[1]。通常認(rèn)為，脊髓損傷后腸道功能障礙與大便干硬導(dǎo)致糞便在結(jié)腸內(nèi)停留時間過長、水分過度吸收等有關(guān)。

水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是控制各種細(xì)胞含水量的膜水通道之一，與先天性白內(nèi)障、腎源性尿崩癥等多種疾病有關(guān)[2]。在胃腸道中，AQPs的異常表達(dá)可見于多種疾病。近年來發(fā)現(xiàn)，腸道黏膜AQPs 過度表達(dá)與便秘存在一定關(guān)系。結(jié)腸中，參與水轉(zhuǎn)運的AQP 包 括AQP1、AQP2、AQP3、AQP4 和AQP8[3‐4]。其中AQP1、AQP3 和AQP4與便秘關(guān)系更密切[5‐6]。Ikarashi等[7‐8]的實驗也證明AQP3功能或表達(dá)的降低會導(dǎo)致腹瀉，推測可能是降低了結(jié)腸管腔側(cè)到血管側(cè)的吸水性。結(jié)腸中的AQPs 可能在一定程度上參與調(diào)節(jié)糞便含水率。

本研究觀察大鼠脊髓損傷后結(jié)腸AQP1、AQP3和AQP4 的表達(dá)變化，檢測其表達(dá)水平與糞便含水率的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

48 只SPF 級Sprague‐Dawley 大鼠，體質(zhì)量(220±10) g，由北京維通利華公司提供，許可證號SCXK(京)2009‐0017，分為對照組(n=24)和脊髓損傷組(n=24)。大鼠單籠飼養(yǎng)，室溫(21±1)℃，濕度30%～70%，12 h黑夜‐白晝循環(huán)，自由取食及飲水。實驗前，所有大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)7 d。研究設(shè)計和實驗操作均符合首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的要求，倫理審查號AEEI‐2019‐045。

1.2 主要試劑及儀器

DH‐101‐2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津中環(huán)實驗電爐有限公司。AQP1 抗體、AQP3 抗體、AQP4 抗體：武漢賽維爾生物科技有限公司。HistoFAXS 軟件：奧地利TISSUE GNOSTICS 公司。1.48 版Image J 軟件：美國國立衛(wèi)生研究院。

1.3 動物模型

術(shù)前禁食不禁水12 h。予動物5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，2%異氟烷維持麻醉。大鼠俯臥位，背部正中切口，顯露T7‐9椎板并去除，顯露胸髓，于T8椎體位置用手術(shù)剪橫斷脊髓，建立T8脊髓損傷模型[9‐11]。脊髓殘端出血，用明膠海綿覆蓋止血，出血通常15～30 s停止。縫合肌肉和皮膚。對照組僅咬開椎板，暴露脊髓后關(guān)閉傷口。術(shù)中大鼠采用體位暖墊保暖。術(shù)后肌注青霉素20萬U，每天1次，連續(xù)7 d。每天兩次給予手動輔助脊髓損傷大鼠排尿，同時按摩和被動活動雙下肢防止壓瘡。

1.4 評定方法

1.4.1 Basso‐Beattie‐Bresnahan(BBB)評分

于造模前，造模后第1、3、7、14、28 天，每組取8 只大鼠，采用BBB 評分評定大鼠雙側(cè)后肢運動功能。將大鼠置于直徑約90 cm、高7～10 cm 的塑料池內(nèi)，底面粗糙，由兩位獨立檢查人員觀察大鼠連續(xù)4 min 內(nèi)的運動能力。0 分，完全下肢癱瘓；21 分運動能力正常[12]。

1.4.2 糞便含水率

術(shù)前，術(shù)后第3、14、28 天，每組取8 只大鼠，評估兩組糞便含水率。評估前3 d 每只大鼠定量給食30 g/d、給水50 ml/d，評估在早晨8 點開始。先將大鼠轉(zhuǎn)移至無墊層的單獨觀察籠中，禁食禁水2 min。2 h 后檢查者用鑷子從大鼠肛門處收集新鮮糞便顆粒，用塑料袋密封，稱濕重；90 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥48 h后，稱得干重。依據(jù)公式計算糞便含水率。

1.4.3 免疫組化技術(shù)檢測AQP1、AQP3 和AQP4 在結(jié)腸組織中的表達(dá)

兩組在術(shù)后第3、14、28 天各處死大鼠8 只，在距肛門3 cm 處切取1 cm 左右結(jié)腸標(biāo)本。4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4～5 μm，脫蠟至水，切片高壓蒸鍋法抗原修復(fù)，PBS 沖洗。分別加AQP1 (GB11310,1∶ 2000)、AQP3(GB11395,1∶1000)、AQP4(GB11311‐1,1∶1000)一抗，4 ℃孵育過夜。0.2% PBS 液沖洗5 min 后，加HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片[15]。采用Histo‐FAXS 軟件對所有切片進(jìn)行20 倍放大成像。采用Im‐age J 軟件測量每張切片陽性著色面積和積分光密度(integrated density,ID)[16]。

1.4.4 脊髓、腸道HE染色

術(shù)后第28 d，將大鼠麻醉(方法同前)，固定(方法同前)后取脊髓損傷區(qū)、結(jié)腸(距肛門3 cm 處) 組織標(biāo)本各1 cm，石蠟包埋，切片5 μm 厚，常規(guī)HE 染色。采用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism v 5.0、SPSS 22.0 生成統(tǒng)計分析。計量資料以(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。組內(nèi)不同時間點比較采用單因方差分析和LSD 檢驗。采用Pearson 相關(guān)分析檢驗糞便水含率與AQPs的相關(guān)性。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

脊髓損傷組出現(xiàn)明顯的便秘、尿潴留等癥狀。對照組未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙或便秘。

2.1 BBB評分

對照組術(shù)后各時間點間BBB 評分無顯著性差異(P>0.05)。脊髓損傷組術(shù)后BBB 評分時間效應(yīng)顯著(P<0.001)，且均顯著低于對照組(P<0.001)。見表1。

2.2 糞便含水率

對照組各時間點糞便含水率無顯著性差異(P>0.05)。脊髓損傷組術(shù)后各時間點糞便含水率均顯著降低(P<0.001)，隨著時間延長略有增加，但均顯著低于對照組(P<0.001)。見表2。

2.3 AQP1、AQP 3、AQP 4在結(jié)腸組織中的表達(dá)

2.3.1 AQP1

AQP1 的表達(dá)主要分布在結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中，在細(xì)胞頂端、基底側(cè)和腔面較為豐富。少量陽性表達(dá)于黏膜下層和肌層。與對照組相比，脊髓損傷組陽性細(xì)胞染色更明顯，呈棕褐色。見圖1。脊髓損傷組第3、14、28 天結(jié)腸黏膜細(xì)胞AQP1 表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.001)。見表3。

2.3.2 AQP3

AQP3 主要表達(dá)在結(jié)腸黏膜頂部的上皮細(xì)胞中，集中在基底面和管腔面，少見于杯狀細(xì)胞，呈黃色或棕黃色。在著色量及程度上，脊髓損傷組高于對照組。見圖2。脊髓損傷組第3、14、28 天結(jié)腸黏膜AQP3表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.001)。見表4。

2.3.3 AQP4

AQP4 陽性細(xì)胞多見于結(jié)腸黏膜頂端，以細(xì)胞膜基底側(cè)為主，杯狀細(xì)胞少見。脊髓損傷組AQP4 陽性細(xì)胞表達(dá)顯著高于對照組。見圖3。脊髓損傷組第3、14、28 天結(jié)腸黏膜AQP4 表達(dá)均明顯高于對照組(P<0.01)。見表5。

表1 各組不同時間點BBB評分比較

表2 各組不同時間點糞便含水率比較

圖1 各組不同時間點結(jié)腸AQP1表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，bar=50 μm)

表3 各組不同時間點結(jié)腸AQP1表達(dá)(×107,ID)

表4 各組不同時間點結(jié)腸AQP3表達(dá)(×107,ID)

2.4 AQPs表達(dá)與糞便含水率的相關(guān)性分析

AQP1、AQP3 和AQP4 均與糞便含水率呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0791～-0.730,P<0.001)。見圖4。

2.5 脊髓、結(jié)腸組織病理

脊髓損傷組脊髓內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，灰白質(zhì)破壞，中央管破裂，神經(jīng)細(xì)胞壞死。對照組脊髓結(jié)構(gòu)完整，灰白質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰。見圖5。脊髓損傷組結(jié)腸見炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)腸隱窩萎縮，吸收細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)目減少，黏液分泌減少。對照組結(jié)腸未見明顯炎癥反應(yīng)。見圖6。

3 討論

結(jié)腸的一個重要功能是重吸收腸道內(nèi)容物的水分。人類的結(jié)腸在滲透壓梯度下每天吸收水分約1.5～2 L。由于結(jié)腸上皮細(xì)胞間連接緊密形成屏障，水由結(jié)腸腔內(nèi)進(jìn)入結(jié)腸黏膜中，需要通過黏膜上皮細(xì)胞上AQPs 轉(zhuǎn)運。在AQP 家族中，AQP1、AQP3、AQP4、AQP7、AQP8都存在于結(jié)腸，與結(jié)腸水的吸收與分泌存在很大關(guān)系[17‐20]，它們的改變可能導(dǎo)致AQP 對水轉(zhuǎn)運的干擾。

圖2 各組不同時間點結(jié)腸AQP3表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，bar=50 μm)

圖3 各組不同時間點結(jié)腸AQP4表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，bar=50 μm)

AQPs 異常表達(dá)可見于多種腸道疾病。在慢傳輸型便秘大鼠模型[21]和糖尿病大鼠鏈脲霉素誘導(dǎo)的胃腸功能障礙[22]中都觀察到AQP1 表達(dá)增加。而在輪狀病毒腹瀉小鼠模型中，結(jié)腸AQP1、AQP4、AQP8 蛋白表達(dá)明顯降低[23]。AQP3 廣泛表達(dá)于遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞[24]，其增加或減少會導(dǎo)致便秘或腹瀉[25‐27]。AQP4 則在結(jié)腸上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜中高度表達(dá)。AQP4 的下調(diào)與腹瀉存在一定關(guān)系[28]。在霍亂毒素引起的腹瀉[29]、過敏性腹瀉[30]和炎癥性腸病患者[31]中，都觀察到AQP4顯著下調(diào)。

表5 各組不同時間點結(jié)腸AQP4表達(dá)(×107,ID)

圖5 兩組脊髓損傷組織(HE染色，×20)

圖6 兩組結(jié)腸組織(HE染色，bar=100 μm)

本研究顯示，脊髓損傷大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞AQP1、AQP3 和AQP4 表達(dá)增加，在脊髓損傷后4 周內(nèi)持續(xù)存在。脊髓損傷后結(jié)腸AQPs 高表達(dá)，有利于水分通過腸壁黏膜。這種通透性變化對水轉(zhuǎn)運是雙向的，可以解釋脊髓損傷患者易出現(xiàn)大便干硬。同時，對瀉藥高度敏感，易導(dǎo)致腹瀉[32]。

脊髓損傷導(dǎo)致結(jié)腸AQPs 升高的原因尚不清楚。結(jié)腸AQPs 的表達(dá)受很多因素影響。滲透性瀉藥硫酸鎂通過增加細(xì)胞內(nèi)Mg2+，激活腺苷酸環(huán)化酶，增加結(jié)腸AQP3 的表達(dá)；刺激性瀉藥比沙可啶能降低結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞AQP3的表達(dá)水平[32]。Itoh等[33]的實驗證明血管活性腸肽通過cAMP依賴通路調(diào)節(jié)AQP3的表達(dá)，影響腸道分泌，與便秘關(guān)系密切。在腸易激綜合征患者中也觀察到5‐羥色胺(5‐hydroxytryptamine,5‐HT)的釋放量增加，提示炎癥及機(jī)械刺激也可促進(jìn)嗜鉻細(xì)胞分泌5‐HT[34]。結(jié)腸黏膜中較高的5‐HT水平可增 加AQP3 的表達(dá)，促進(jìn)水從管腔運輸至血管側(cè)面，導(dǎo)致大便硬化[35‐37]。

脊髓損傷后血管自主神經(jīng)失調(diào)，遠(yuǎn)端結(jié)腸腸系膜動脈基礎(chǔ)血灌注減少，結(jié)腸炎性因子表達(dá)上調(diào)[38]。由于腸道運動減慢，糞便長期滯留，結(jié)腸內(nèi)炎性因子異常積累，腸道菌群增殖移位，進(jìn)一步加重腸道慢性炎癥的發(fā)生[39]。本研究中，脊髓損傷組結(jié)腸組織有炎性細(xì)胞浸潤。因此，脊髓損傷后結(jié)腸炎癥可能是導(dǎo)致腸黏膜AQPs異常表達(dá)的重要因素。

脊髓損傷后，由于失去中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制，各種組織的自主神經(jīng)受體表達(dá)和反應(yīng)性在損傷水平以下經(jīng)常發(fā)生改變，自主神經(jīng)回路發(fā)生重組[40]。腸道內(nèi)受體表達(dá)和激素分泌也會發(fā)生適應(yīng)性改變[41‐42]，這也可能導(dǎo)致AQPs的異常表達(dá)。

目前對脊髓損傷后腸道功能障礙的研究多關(guān)注腸道動力下降，結(jié)腸傳輸時間延長[43‐44]，糞便干硬，便秘嚴(yán)重。盡管脊髓損傷組和正常組結(jié)腸傳輸時間有差異，但我們通過在相同時間段內(nèi)測定兩組糞便含水率和AQPs 的變化，可以有效消除傳輸時間不同造成的影響。本研究結(jié)果顯示，脊髓損傷后大鼠結(jié)腸黏膜AQPs 高表達(dá)，至少持續(xù)到4 周，且AQPs 過度表達(dá)與結(jié)腸糞便含水率有顯著相關(guān)性，提示除腸道運動減慢、結(jié)腸傳輸時間延長外，結(jié)腸AQPs 的過度表達(dá)可能也是加重大鼠脊髓損傷后便秘的原因之一。

本研究尚有一些不足之處。研究周期較短，未對脊髓損傷后腸道AQPs變化進(jìn)行長期觀察。AQPs在結(jié)腸黏膜中的表達(dá)變化是本研究的重點，而其在脊髓損傷后的變化機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，我們首次觀察到脊髓損傷可導(dǎo)致大鼠結(jié)腸AQPs 過表達(dá)，與脊髓損傷后結(jié)腸水分過度吸收有關(guān)。本研究具有一些潛在臨床優(yōu)勢可為脊髓損傷患者的便秘治療提供研究方向。