王昌高，昝 慧，張萬里，田愛霞，胡艷艷

1.海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，海南 ?？?570311；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心；3.湖北文理學院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科

胃癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著胃癌篩查工作的開展及相關危險因素的控制，胃癌整體發(fā)病率和死亡率有所下降但仍處于較高水平，因此胃癌防治仍不容忽視[1]?；熓侵委熤型砥谖赴┑闹饕侄危M管在臨床化療中以順鉑為主的鉑類藥物取得了一定成效，但胃癌耐藥問題的出現(xiàn)嚴重影響了治療效果，是導致胃癌治療失敗的主要原因之一[2]。

近年來，靶向藥物的應用在一定程度上改善了胃癌細胞的多藥耐藥性，在胃癌治療中取得了較好療效[3-5]。但胃癌具有異質(zhì)性，目前的分子靶向治療效果不盡人意，因此，研究更有針對性的靶向藥物對胃癌治療意義重大。

胡桃醌(又名5-羥基-1，4-萘醌，Juglone)是一種PIN1天然抑制劑，已有研究[6-8]表明，胡桃醌在胃癌、膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌等多種惡性腫瘤中具有很好的抗腫瘤活性。但胡桃醌對胃癌細胞耐藥性的影響及其潛在機制尚未見報道。本研究以人胃癌/順鉑耐藥細胞株BGC-823/DDP為研究對象，探討胡桃醌對細胞耐藥敏感性的影響及其潛在分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞：人胃癌/順鉑耐藥細胞株BGC-823/DDP和人胃黏膜上皮正常細胞系GES-1由美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)提供。

1.1.2 主要試劑：胡桃醌(Juglone，純度≥98%，Sigma公司)；順鉑(DDP，Sigma公司)；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液(Hyclone公司)；MTT溶液和二甲基亞砜(Sigma公司)；P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、Caspase-3、Caspase-9、膜聯(lián)蛋白A2(membrane linked protein A2，ANXA2)、切除修復交叉互補基因1(excision repair cross complementary gene 1，ERCC1)、p-AKT和p-mTOR特異性一抗及相應二抗(Abcam公司)；Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將BGC-823/DDP細胞接種于含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃，體積分數(shù)為5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3～5 d傳代1次。實驗前2周培養(yǎng)液中加入適量DDP以維持細胞耐藥性。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖活性：取對數(shù)生長期的BGC-823/DDP和GES-1細胞，按1×104ml-1的密度接種于96孔板，隨機分組：對照組、胡桃醌組、順鉑組、胡桃醌聯(lián)合順鉑組、LY294002(AKT抑制劑)聯(lián)合順鉑組。胡桃醌組分別加入胡桃醌終濃度2.25 μmol/L、4.5 μmol/L、9 μmol/L、18 μmol/L、36 μmol/L、72 μmol/L、144 μmol/L；順鉑組加入終濃度10 μmol/L的DDP；胡桃醌聯(lián)合順鉑組在10 μmol/L DDP的基礎上分別加入胡桃醌4.5 μmol/L、9 μmol/L、18 μmol/L，LY294002聯(lián)合順鉑組在10 μmol/L DDP的基礎上給予LY294002處理。每組設置5個重復孔并重復3次。干預48 h后，避光條件下每孔分別先后加入20 μl MTT溶液和150 μl二甲基亞砜反應。酶標儀下測定每組細胞490 nm波長處吸光度(absorbance，A)值。

1.2.3 Western blotting檢測相關蛋白表達：取對照組及藥物處理各組BGC-823/DDP細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并定量。將蛋白樣品與上樣緩沖液按1∶5混合后放于100 ℃水浴鍋中變性5 min，質(zhì)量濃度為100 g/L的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉封膜1 h，加入稀釋后的P-gp、MRP1、Caspase-3、Caspase-9、ANXA2、ERCC1、p-AKT和p-mTOR特異性一抗，4 ℃過夜孵育，然后加入相應二抗室溫孵育2 h。TBST溶液洗膜，加入ECL發(fā)光液中顯影，BIO-RAD凝膠成像儀中曝光，保存圖像應用Quantity One圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參對照計算目的蛋白相對表達水平。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況：取對照組及藥物處理各組BGC-823/DDP細胞，以1×106ml-1的密度加入流式管中，1 000×g離心5 min收集細胞，PBS溶液洗滌細胞2次。按照Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒說明書，加入1×Binding Buffer重懸細胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，再加入10 μl PI染色液冰浴下孵育5 min，流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度胡桃醌處理對人胃黏膜上皮正常細胞系GES-1和人胃癌/順鉑耐藥細胞株BGC-823/DDP細胞活性的影響如圖1A所示，BGC-823/DDP細胞生長狀態(tài)良好；MTT實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，胡桃醌濃度≥18 μmol/L時GES-1細胞增殖活性明顯降低(P<0.05，見圖1B)；胡桃醌濃度≥4.5 μmol/L時BGC-823/DDP細胞增殖活性明顯降低(P<0.05，見圖1C)。因此，選用胡桃醌濃度4.5 μmol/L、9 μmol/L、18 μmol/L用于以下實驗。

2.2 不同濃度胡桃醌對BGC-823/DDP細胞IC50及P-gp、MRP1蛋白表達的影響與對照組比較，胡桃醌不同濃度對BGC-823/DDP細胞增殖抑制率均升高(P<0.05)，細胞中P-gp、MRP1蛋白相對表達水平均明顯降低(P<0.05)；且9 μmol/L胡桃醌和18 μmol/L胡桃醌對BGC-823/DDP細胞的增殖抑制率高于4.5 μmol/L胡桃醌(P<0.05)，且細胞中P-gp、MRP1蛋白相對表達水平低于4.5 μmol/L胡桃醌組(P<0.05，見圖2)。

注：1： 對照組；2： 2.25 μmol/L胡桃醌組； 3： 4.5 μmol/L胡桃醌組； 4： 9 μmol/L胡桃醌組； 5： 18 μmol/L胡桃醌組； 6： 36 μmol/L胡桃醌組； 7： 72 μmol/L胡桃醌組； 8： 144 μmol/L胡桃醌組。與對照組比較，*P<0.05。

注：1： 對照組；2： 4.5 μmol/L胡桃醌組； 3： 9 μmol/L胡桃醌組； 4： 18 μmol/L胡桃醌組。與對照組比較，*P<0.05；與4.5 μmol/L胡桃醌組比較，#P<0.05。

2.3 不同濃度胡桃醌對BGC-823/DDP細胞凋亡和凋亡相關蛋白表達的影響與對照組比較，10 μmol/L順鉑組BGC-823/DDP細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，細胞中凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-9相對表達水平明顯升高(P<0.05)；與10 μmol/L順鉑組比較，胡桃醌不同濃度處理組BGC-823/DDP細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，細胞中Caspase-3和Caspase-9蛋白相對表達水平明顯升高(P<0.05)；且9 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組和18 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組BGC-823/DDP細胞凋亡率及細胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達水平均明顯高于4.5 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組(P<0.05，見圖3)。

2.4 不同濃度胡桃醌對BGC-823/DDP細胞中ANXA2和ERCC1表達的影響與對照組比較，10 μmol/L順鉑組BGC-823/DDP細胞中ANXA2、ERCC1蛋白相對表達水平明顯降低(P<0.05)；與10 μmol/L順鉑組比較，胡桃醌不同濃度處理組BGC-823/DDP細胞中ANXA2、ERCC1蛋白相對表達水平明顯降低(P<0.05)；且9 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組和18 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組BGC-823/DDP細胞中ANXA2、ERCC1蛋白相對表達水平明顯低于4.5 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組(P<0.05，見圖4)。

注：1: 對照組； 2: 10 μmol/L順鉑組； 3: 4.5 μmol/L胡桃醌組+10 μmol/L順鉑組; 4: 9 μmol/L胡桃醌組+10 μmol/L順鉑組； 5: 18 μmol/L胡桃醌組+10 μmol/L順鉑組。與對照組比較，*P<0.05；與10 μmol/L順鉑組比較，#P<0.05；與4.5 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組比較，&P<0.05。

注：1: 對照組； 2: 10 μmol/L順鉑組； 3: 4.5 μmol/L胡桃醌組+10 μmol/L順鉑組; 4: 9 μmol/L胡桃醌組+10 μmol/L順鉑組； 5: 18 μmol/L胡桃醌組+10 μmol/L順鉑組。與對照組比較，*P<0.05；與10 μmol/L順鉑組比較，#P<0.05；與4.5 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組比較，&P<0.05。

2.5 不同濃度胡桃醌對BGC-823/DDP細胞AKT/mTOR信號通路的影響與對照組比較，10 μmol/L順鉑組BGC-823/DDP細胞中p-AKT、p-mTOR蛋白相對表達水平明顯降低(P<0.05)；與10 μmol/L順鉑組比較，胡桃醌不同濃度處理組BGC-823/DDP細胞中p-AKT、p-mTOR蛋白相對表達水平明顯降低(P<0.05)；且9 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組和18 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組BGC-823/DDP細胞中p-AKT、p-mTOR蛋白相對表達水平明顯低于4.5 μmol/L胡桃醌+10 μmol/L順鉑組(P<0.05，見圖5)。

2.6 AKT抑制劑對BGC-823/DDP細胞IC50和凋亡的影響與10 μmol/L順鉑組比較，LY294002+10 μmol/L順鉑組BGC-823/DDP細胞的增殖抑制率明顯升高(P<0.05)，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)(見圖6)。

注：1: 對照組； 2: 10 μmol/L順鉑組； 3: 4.5 μmol/L胡桃醌組+10 μmol/L順鉑組; 4: 9 μmol/L胡桃醌組+10 μmol/L順鉑組； 5: 18 μmol/L胡桃醌組+10 μmol/L順鉑組。與對照組比較，*P<0.05；與10 μmol/L順鉑組比較，#P<0.05；與4.5 μmol/L胡桃醌+順鉑組比較，&P<0.05。

注：與10 μmol/L順鉑組比較，*P<0.05。

3 討論

肽酰脯氨酰順反異構酶(PIN1)被認為是腫瘤發(fā)生的催化因子，在胃癌中高表達，與胃癌分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為密切相關，可能是胃癌防治的潛在靶點[9]。胡桃醌作為PIN1的抑制劑，越來越多的學者關注其在腫瘤中的抗腫瘤活性及其作用機制。Wang等[10]報道，胡桃醌以時間依賴性方式抑制PIN1表達，并通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號傳導途徑抑制膠質(zhì)瘤細胞生長、遷移并破壞血管生成，誘導細胞凋亡，具有抗膠質(zhì)瘤的體外功效。Liu等[11]報道，胡桃醌能夠通過ROS-p38-p53途徑介導，增強腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)誘導的黑色素瘤細胞凋亡。此外，有研究表明，PIN1高表達促進宮頸癌、乳腺癌細胞化療耐藥，提示PIN1可能是腫瘤化療敏感性的干預靶點[12-13]。但目前胡桃醌在包括胃癌的腫瘤細胞化療耐藥中的作用鮮有報道。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度胡桃醌處理后，胃癌BGC-823/DDP細胞的IC50和細胞中P-gp和MRP1蛋白表達明顯降低，細胞凋亡率增加，細胞中凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-9表達水平升高。P-gp和MRP1是多藥耐藥相關蛋白，在腫瘤細胞中高表達可導致細胞多藥耐藥。說明胡桃醌能增強胃癌BGC-823/DDP細胞對DDP的敏感性，降低細胞耐藥性，促進細胞凋亡。ANXA2是一種Ca2+調(diào)節(jié)磷脂結(jié)合蛋白，相關研究表明，ANXA2基因在胃癌細胞中異常表達與胃癌耐藥有關，并證實抑制ANXA2能有效抑制胃癌細胞中耐藥相關基因表達，促進凋亡基因表達，降低胃癌細胞耐藥性，其作用機制可能與MAPK和PI3K/AKT信號通路有關[14-15]。ERCC1是核苷酸切除修復活性的標志基因，Wan等[16]報道，ERCC1在胃癌細胞中高表達與鉑類化療耐藥性呈正相關。本研究結(jié)果顯示，不同濃度胡桃醌處理后胃癌BGC-823/DDP細胞中ANXA2、ERCC1蛋白表達降低，提示胡桃醌對胃癌細胞耐藥性的影響可能與調(diào)控ANXA2、ERCC1蛋白表達有關。

AKT/mTOR信號通路是細胞增殖相關的關鍵通路之一，其調(diào)控的細胞增殖失調(diào)是腫瘤耐藥的重要原因[17-18]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度胡桃醌處理后胃癌BGC-823/DDP細胞中p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平降低，說明胡桃醌抑制胃癌細胞中AKT和mTOR磷酸化，抑制AKT/mTOR信號通路激活。此外，本研究使用AKT抑制劑阻斷胃癌BGC-823/DDP細胞中AKT磷酸化，結(jié)果顯示細胞對DDP的IC50降低，細胞凋亡率增加，說明阻斷AKT信號通路增強胃癌細胞順鉑敏感性。Zhang等[19]報道，ANXA2在胃癌SGC7901/DDP細胞中高表達，敲除ANXA2后以與p38MAPK和AKT抑制劑相似的方式增強細胞對DDP和5-FU的藥物敏感性，提示ANXA2通過調(diào)控p38MAPK和AKT途徑參與胃癌耐藥性。Wang等[20]報道，ERCC1基因在非小細胞肺癌耐藥細胞中過表達，通過激活PI3K/AKT信號通路控制肺癌發(fā)展。提示胡桃醌增強胃癌SGC7901/DDP細胞對順鉑的敏感性可能與抑制細胞中AKT/mTOR信號通路激活有關。

綜上所述，胡桃醌能夠有效增強胃癌細胞對順鉑的敏感性，抑制細胞中ANXA2和ERCC1表達，抑制多藥耐藥相關基因表達，促進凋亡相關蛋白表達，并抑制AKT和mTOR磷酸化。但其作用分子機制及其是否還參與其他信號通路調(diào)控尚需進一步探討。本研究為胡桃醌在胃癌分子靶向治療及逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥中的應用提供了一定實驗依據(jù)。