吳信舉 陶周善 陸漢力 萬亮亮 丁國正 祁國慶 謝加兵 章榮

皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院/弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽蕪湖241000

在整個生命過程中，骨骼經歷了一個連續(xù)的重塑過程，涉及骨吸收和骨形成。在骨骼生長期間和年輕成人期間，存在積極的骨平衡，即形成的骨骼多于被吸收的骨骼，然后達到平衡。但是在40歲之后，重吸收的骨組織比產生的多。這種現(xiàn)象可能會導致骨質疏松癥狀隨著衰老而變得更加嚴重［1］。在絕經后的女性中，缺乏雌激素是損害骨質量的另一個因素，因此導致骨質疏松癥，利于骨折的發(fā)生。治療骨質疏松性骨折是一項挑戰(zhàn)，因為老年患者更容易受到手術和麻醉并發(fā)癥的影響。此外，骨質疏松骨不能為整形外科植入物提供良好的錨固［2］。骨折后的骨愈合是一個專門的修復過程，涉及一系列事件，包括炎癥、成骨、愈傷組織形成和重塑［3］。最近已經證明卵巢切除動物(OVX)中雌激素受體表達的失調會損害骨愈合，這可以通過降低血管生成因子、減少骨形成標志物和增加骨吸收來證明，導致愈合延遲或不愈合。越來越多的證據［4］表明，維生素K2參與骨代謝，可能對骨質疏松癥有益。維生素K2是骨鈣素的一種羧化作用，骨鈣素是一種含有c－羧基谷氨酸的骨基質蛋白，在骨代謝中起關鍵作用［5］。然而，膳食攝入維生素K2不足以支持骨鈣蛋白和基質GLA蛋白的完全羧化。重要的是，據報道補充維生素K2會增加c－羧化骨鈣素的水平并抑制骨質流失［6］。維生素K2在骨代謝中的重要性進一步得到體外研究的支持，該研究表明維生素K2對成骨細胞骨形成具有刺激作用，同時對破骨細胞骨吸收具有抑制作用［7］。因此，補充維生素K2可能具有作為骨質疏松癥治療方法的功效。然而，骨折后給予抗骨質疏松癥治療會刺激骨形成和骨折修復。因此，接受維生素K2可能對骨折愈合產生有益效果，本研究將評估維生素K2對切除卵巢大鼠骨折愈合的影響。

1 材料和方法

1.1 動物和造型方法

30只6月齡Sprague－Dawley(SD)雌性大鼠獲自皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院。將大鼠圈養(yǎng)在溫度受控的室內(25℃)，恒定濕度(40%～50%)并可以自由接近食物和水。將大鼠放置1周以適應環(huán)境，經歷12 h/12 h光/暗循環(huán)。大鼠被隨機分為假手術組(SHAM)、去卵巢組(OVX)、OVX+維生素 K2組，每組10只大鼠。首先以3 mL/kg的劑量在腹膜內注射10%水合氯醛，對20只雌性大鼠通過背部切口進行雙側卵巢切除術，切開大約1.5 cm的皮膚、腹腔和肌肉并暴露卵巢。將輸卵管用絲線結扎并進行雙側卵巢切除術，其余10只動物進行假手術，檢查雙側卵巢并在相同方案下恢復到原來位置。大鼠卵巢切除術后3個月，在麻醉狀態(tài)下將其右側股骨制作成股骨干中段骨折，并用髓內釘固定(直徑1 mm，長度 50 mm;Wego Medical Systems Co．，Ltd，威海，中國)。所有程序均經皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院動物研究倫理委員會批準。

1.2 治療方法和標本收集

將15 mg固力康膠囊(四烯甲萘醌軟膠囊，15 mg/粒，國藥準字J20100149，富士膠囊株式會社芝川工廠)溶入5 mL的氯化鈉。OVX+維生素K2組骨折術后每天給予固力康6 mg(kg·d)灌胃治療，在右側股骨干骨折髓內固定術后口服給藥。SHAM組和OVX組口服等量的0.9%氯化鈉。治療后8周使用雙能 X射線吸收測定儀(DSC－3000，Aloka，Tokyo，Japan)測量骨密度(mg/cm2)。通過頸椎脫位處死大鼠。處死后從下腔靜脈抽血，加入抗凝劑中，以3 000 r/min的速度攪拌20 min，提取血漿。將提取的血漿儲存在－70℃直至分析使用。

1.3 檢測指標

藥物治療后8周采集X射線(800 mA，150 kV，R－500;GE Healthcare Bio－Sciences，Pittsburgh，PA，USA)觀察骨折愈合情況;同時檢測骨折區(qū)域骨強度，使用DL3000型通用機器EMIC對分離的右脛骨進行三點彎曲測試評估。通用機器以5 mm/min的加載速率裝配2 000 N容量的測力傳感器。在右脛骨骨干彎曲試驗中，支架兩點之間的距離標準化為三分之二的試樣，并且施加的負荷距各端等距。使用以下結構－機械性能進行測試:彈性(mJ)，其被定義為樣品在彈性相中允許的能量;最大載荷(N)和剛度(103N/m)，它被定義為表示結構剛度的載荷和變形之間的關系。作為骨形成標志的血清骨鈣素(BGLAP)、堿性磷酸酶(ALP)，各自用ELISA試劑盒(R＆D Systems，Inc．，Minneapolis，MN，USA)測量，同時使用ELISA試劑盒(R＆D Systems，Inc)測量抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)和血液雌二醇水平。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據均以均數(shù)±標準差表示，并使用SPSS 19.0版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。單因素方差分析用于評估各組之間的差異。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

大鼠股骨的X射線顯示OVX大鼠的不完全愈合，通過維生素K2治療后得到明顯改善。治療后8周觀察到維生素K2對骨痂組織形成、重塑和骨愈合的影響明顯。OVX+維生素K2組在8周時觀察到骨痂形成和骨折愈合良好，但是在OVX組中，形成較小的骨痂組織并且重建不完整，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的骨愈合(圖1)。

OVX大鼠的BGLAP和ALP水平增加，并通過維生素K2治療后顯著改善。口服治療8周后，OVX組與SHAM組相比，BGLAP和ALP水平顯著升高(P＜0.05)。與OVX組相比，OVX+維生素K2組BGLAP和ALP水平顯著降低(P＜0.05，圖2，圖3 A)。

在OVX大鼠中觀察到血液TRACP及雌二醇水平的變化，其在維生素K2處理后未被逆轉。與SHAM組相比，OVX大鼠的血液雌二醇顯著降低(P＜0.05)，而 TRACP水平顯著升高(P＜0.05)。然而，與OVX組相比，OVX+維生素K2組血液雌二醇沒有顯著增加(P＞0.05，圖3 A)，而TRACP水平顯著降低(P＜0.05)。

與SHAM組相比，OVX組檢測結果顯示股骨骨折區(qū)域剛度、最大載荷和彈性顯著降低(P＜0.05);而OVX+維生素K2組的剛度、最大載荷和彈性在治療8周后較OVX組顯著增加(P＜0.05，圖4)。

圖2 維生素K2治療8周后對骨形成標志物血液骨鈣蛋白(A)和堿性磷酸酶(B)的影響(與SHAM組相比，*P＜0.05;與OVX組相比，#P ＜0.05)Fig．2 Effects of 8 weeks of Vitamin K2 treatment on bone formation markers(A)blood osteocalcin and(B)alkaline phosphatase

圖3 維生素K2治療8周后對骨吸收標志物TRACP和血液雌二醇水平的影響(與SHAM組相比，*P＜0.05;與OVX組相比，#P＜0.05)Fig．3 Effects of 8 weeks of Vitamin K2 treatment on bone resorption marker TRACP and blood estradiol levels

圖4 三點彎曲測試結果Fig．4 Results of the three－point bending test

3 討論

骨質疏松癥是相對于骨形成而骨吸收增加，導致正常骨重建紊亂、骨量低、骨折風險高［8］。據報道，僅在美國，骨質疏松癥就影響了大約2 500萬人，＞50歲的女性患髖部骨折的風險為大約為11%～18%［9］。因此，為了預防和治療骨質疏松癥，通常使用藥物、運動和其他治療方案如激素替代療法。其中，激素替代療法是最廣泛使用的;然而，之前的證據表明，使用這些藥物進行長期治療可能會引起不良反應，例如卵巢癌和子宮內膜癌的風險增加［10］。因此，需要具有已證實功效和安全性的替代治療策略。

據報道，維生素K2對骨骼具有合成代謝作用，這可能有助于其在誘導成骨細胞增殖和分化中的作用，從而產生骨形成。卵巢切除術模型是骨質疏松癥研究中公認的動物模型［11］。OVX大鼠模型被選擇用于本研究，因為它與絕經后骨丟失有許多相似之處，并且被美國食品和藥品管理局推薦為評估骨質疏松癥治療的具有長期骨骼安全性和功效的測試物種。以前的實驗室研究報道，骨質疏松癥會影響早期和晚期的骨折愈合［12］。骨密度降低是危及骨強度的主要因素之一，導致骨折易感性增加［13］。本研究顯示，OVX可降低雌性SD大鼠的股骨骨密度，而維生素K2治療可預防骨密度降低。

BGLAP與骨中的羥基磷灰石和鈣緊密結合，是一種確定的骨形成標志物，用于預測骨丟失率，因為它在骨生成過程中間接參與成骨細胞的活化［14］。ALP是一種水解酶，負責從許多類型的分子中去除磷酸基團，包括核苷酸、蛋白質和生物堿［15］。ALP在活躍的骨形成過程中增加，因為ALP是成骨細胞活性的副產物(其水平升高出現(xiàn)在佩吉特病中)［16］。TRACP是在哺乳動物中表達的糖基化單體金屬蛋白酶，可以作為骨吸收標志物。作為骨基質磷蛋白的骨橋蛋白和骨涎蛋白是高效的體外TRACP底物，其在磷酸化時與破骨細胞結合。部分去磷酸化后，骨橋蛋白和骨涎蛋白不能與破骨細胞結合［17］。從這種效應來看，已經假設TRAP是從破骨細胞的皺褶膜中分泌出來的，它會使骨橋蛋白去磷酸化并使破骨細胞遷移并發(fā)生額外的再吸收［18］。OVX組顯著增加了血液BGLAP、ALP和TRACP水平，而OVX+維生素K2組則顯著改善了骨轉換。

這些結果可能是由于雌激素減少所以增加了成骨細胞和破骨細胞的數(shù)量，或者這些細胞活性產生了改變。最常見的骨質疏松癥是與卵巢激素缺乏相關的絕經后骨質流失［19］。以前的幾項研究報告指出，雌激素是維持骨量最重要的激素，這種激素的缺乏是兩性中與年齡相關骨丟失的主要原因［20］。值得注意的是，當循環(huán)的雌激素水平降低時，骨骼中的鈣迅速減少，并且通過尿排泄的增加發(fā)生鈣丟失［21］。在目前的研究中，使用ELISA試劑盒測量大鼠血液雌二醇水平。與SHAM組相比，經歷卵巢切除術誘導的大鼠表現(xiàn)出血液雌二醇水平的顯著降低。在本研究中，灌胃治療8周的OVX+維生素K2組顯示血液雌二醇與OVX組相比無顯著增加，表明維生素K2并不是通過改善體內雌激素來促進骨形成。

本研究通過X射線檢查，探討了維生素K2治療8周后對愈傷組織形成、重塑和骨愈合的影響。SHAM組每2周愈傷組織形成和骨愈合增加，假手術后8周骨折線模糊。在OVX組中，形成了小的愈傷組織并且骨折線明顯，表明沒有愈合。經過維生素K2給藥后，骨痂組織形成和骨愈合明顯加速，骨折線幾乎不存在，并且8周后觀察到骨愈合和重塑。

綜上，本研究表明，維生素K2可減輕骨量減少大鼠骨密度的降低，在骨折后給藥可加速礦化和骨生成，并能改善骨折愈合。維生素K2有望成為絕經后骨質疏松癥骨折愈合的輔助治療方案，但是其發(fā)揮這些作用的機制仍有待研究。