熊一鍵，王晨昱,魏冉月,孫小琴

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隨著人們對膳食脂肪酸組成與人體健康關(guān)系認(rèn)識的加深，乳和乳制品的脂肪酸組成調(diào)控研究備受關(guān)注，而準(zhǔn)確分析乳樣的脂肪酸組成則是此類研究的基礎(chǔ)[1]。各種脂肪酸的良好分離是進(jìn)行脂肪酸定性和定量分析的前提。乳中的脂肪酸種類眾多且含量變異較大[2]，尤其是含有18個(gè)碳原子的C18脂肪酸，除了不含雙鍵的硬脂酸(C18:0)外，還存在多種含有1～6個(gè)不等雙鍵的單不飽和與多不飽和脂肪酸，且這些脂肪酸每一種都存在多個(gè)由于雙鍵位置和雙鍵順、反式結(jié)構(gòu)不同的同分異構(gòu)體，種類眾多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其主要原因是瘤胃微生物對飼料中亞油酸(C18:2n-6)和亞麻酸(C18:3n-3)的不完全氫化、異構(gòu)化以及乳腺組織對該類脂肪酸的去飽和作用[3-4]。乳中C18脂肪酸的種類及其含量既與人體健康密切相關(guān)，又反映著動(dòng)物瘤胃和乳腺組織中的脂肪酸代謝，因此，對其進(jìn)行準(zhǔn)確分析對于反芻動(dòng)物乳脂代謝調(diào)控研究至關(guān)重要。

然而，乳中C18脂肪酸的同分異構(gòu)體受動(dòng)物品種、飼料組成等多種因素影響，含量變異較大，分離難度極大，尤其是一些含量較低但具有重要生物學(xué)意義的脂肪酸，如含t10雙鍵的C18:1和C18:2同分異構(gòu)體。該類脂肪酸含量的增加被認(rèn)為與瘤胃脂肪酸代謝異常和乳脂品質(zhì)降低以及奶牛乳脂合成過程被抑制有關(guān)[5]，但這類脂肪酸正常情況下在乳脂中含量極低，氣相色譜(Gas chromatography, GC)分離條件不適宜時(shí)，t10脂肪酸的峰往往被周圍含量較高的脂肪酸峰掩蓋而無法分離，影響研究結(jié)果甚至?xí)?dǎo)致錯(cuò)誤的研究結(jié)論。有研究報(bào)道認(rèn)為GC的溫度程序會影響C18脂肪酸的分離效果[6-7]。除了現(xiàn)有分析中最常用的175 ℃升溫程序外，有研究表明150 ℃升溫或170 ℃等溫程序更有助于C18脂肪酸的分離[8]。而本實(shí)驗(yàn)室多年的脂肪酸分析實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，樣品濃度可能也會影響C18脂肪酸的分離效果。因此，為了更好地分離乳樣中的C18脂肪酸，以便對其準(zhǔn)確鑒定和定量，本試驗(yàn)選擇了4種來源不同的乳樣，比較研究3種溫度程序(175 ℃、150 ℃、170 ℃)和3種樣品濃度(提取的原液、2倍稀釋液、5倍稀釋液)對其中C18脂肪酸分離效果的影響，旨在為相關(guān)研究中C18脂肪酸測定方法的建立提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)處理

本試驗(yàn)選擇8個(gè)乳樣，其中5個(gè)來自本實(shí)驗(yàn)室前期的一個(gè)飼養(yǎng)試驗(yàn)，乳脂特性比較一致，另外3個(gè)分別為采自西北農(nóng)林科技大學(xué)生態(tài)養(yǎng)殖基地的鮮牛奶、鮮羊奶和自超市購買的某品牌袋裝乳樣，乳脂特性差異較大。首先將所選乳樣取1 mL凍干后進(jìn)行甲酯化處理并用2 mL正己烷提取脂肪酸甲酯(詳細(xì)步驟見1.2)，制成每種乳樣的原液，然后取一定量原液用正己烷進(jìn)行2倍和5倍稀釋，得到2倍和5倍稀釋液。最后，對所有樣品的原液和稀釋液用表1所示的3種溫度程序分別進(jìn)行GC分析，比較不同溫度程序和樣品濃度對乳樣C18脂肪酸分離效果的影響。

1.2 脂肪酸測定方法

樣品脂肪酸的酯化采用直接酯化法進(jìn)行[9]，具體方法為：取1 mL乳樣于10 mL玻璃試管中，-80 ℃冷凍并凍干。加入50 μL的內(nèi)標(biāo)C19:0甲酯，4 mL 0.5 mol/L的NaOH/甲醇溶液，混勻，于50 ℃水浴加熱15 min，冷卻后加入4 mL 2% H2SO4/甲醇溶液，混勻后于50 ℃水浴加熱1 h，冷卻后加入2 mL正己烷和2 mL蒸餾水，混勻，3 500 r/min離心5 min，取0.5 mL上層的正己烷層于GC小瓶中，作為原液于-20 ℃保存。另取2份0.25 mL正己烷層樣品與GC小瓶中，用正己烷進(jìn)行2倍和5倍稀釋，-20 ℃保存。

樣品的脂肪酸分析用GC(安捷倫7820a, Agilent Technologies,千川，陜西)進(jìn)行，色譜柱為Selected CP 7420毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm，Agilent Technologies)。GC條件：氮?dú)庾鳛檩d氣，分離比30：1，進(jìn)樣器和檢測器均為260 ℃，色譜柱溫度程序如表1所示。主要C18脂肪酸的鑒定用ME61作為外標(biāo) (Larodan Fine Chemicals AB, Sweden)，而多眾多無商業(yè)外標(biāo)的C18:1 (trans-4, trans-5, trans-6/7/8, trans-9, trans-10, trans-11, trans-12, trans-13, cis-9, trans-15, cis-11, cis-12, cis-13, trans-16, cis-15)、C18:2 (trans-9trans-12，cis-8trans-13，trans-8cis-13，cis-9trans-12，trans-9cis-12, trans-11cis-15) 脂肪酸的鑒定參考Loor等[10]報(bào)道的C18脂肪酸圖譜進(jìn)行。

表1 氣相色譜溫度程序Table 1 The Gas chromatograph temperature programs

2 結(jié)果與分析

2.1 175 ℃升溫程序?qū)Σ煌匦匀闃釉篊18脂肪酸的分離效果

乳脂性質(zhì)相近(圖1)和相異(圖2)乳樣中C18脂肪酸的分離效果圖表明，175 ℃升溫程序能分離大部分C18脂肪酸，對C18:2脂肪酸的分離差異不大，但對C18:1脂肪酸的分離效果不同。由圖2可知，乳脂特性不同的乳樣，其C18脂肪酸含量差異很大，且分離效果不同。在175 ℃升溫程序下，試驗(yàn)所用的鮮牛奶、鮮羊奶中的C18:1t5～t9同分異構(gòu)體呈一個(gè)峰形出現(xiàn)，分離效果較差，且t10與t11同時(shí)出峰，無法分開，而袋裝牛奶樣和前期試驗(yàn)牛奶樣可部分出現(xiàn)C18:1t10峰形(圖2箭頭所示部分)，但與C18:1t11間的分離效果并不是很好。因此，不同特性的乳樣原液在同一溫度程序下的分離效果不同，且在175 ℃升溫程序下不能很好地分離C18:1t5～C18:1t11同分異構(gòu)體。

2.2 溫度程序?qū)θ闃覥18脂肪酸分離效果的影響

由圖3可知，3種溫度程序?qū)18:1脂肪酸的分離效果差異很大且各有特點(diǎn)：就C18:1t6～t10的分離效果而言，以150 ℃升溫程序最好，同時(shí)，還可將C18:1t16與C18:1c15分離開，但該程序也有缺陷，不能從C18:1c9中洗脫出C18:1t12/13/14和C18:1t15；與150 ℃升溫程序相比，170 ℃等溫程序和175 ℃升溫程序?qū)18:1t6～t10的分離效果都較差，但170 ℃等溫程序可將C18:1t12/13/14和C18:1t15從C18:1c9中分離出來，而175 ℃升溫程序則只可分離出C18:1t12/13/14，無法分離C18:1t15。

3種溫度程序?qū)18:2脂肪酸的分離效果(圖4)主要在于改變了C18:2c9t12和C18:2t11c15脂肪酸的出峰順序。其中，在170 ℃等溫程序中，C18:2c9t12和C18:2t11c15在C19:0與C18:2n-6之間出峰，且分離效果不佳；在175 ℃升溫程序中，C18:2c9t12和C18:2t11c15的分離較好，且C18:2c9t12的出峰在C19:0之前；而在150 ℃升溫程序中， C18:2c9t12和C18:2t11c15的出峰在C19:0之前，但分離效果不佳。相對而言，175 ℃升溫程序C18:2c9t12和C18:2t11c15的分離較好。

2.3 樣品濃度對乳樣C18脂肪酸分離效果的影響

由圖5和圖6可知，樣品濃度對C18:1脂肪酸分離的影響主要體現(xiàn)在對C18:1t6～C18:1t11的分離效果上(圖5)：在各種溫度程序下，原液中的C18:1t6～C18:1t11分離效果均不如2倍和5倍稀釋液，尤其是170 ℃等溫程序和175 ℃升溫程序中。在150 ℃升溫程序下，2倍和5倍稀釋液的分離效果明顯優(yōu)于原液，且C18:1t12/13/14在低濃度時(shí)也可以被溶出。同時(shí)，隨著樣品稀釋， 175 ℃升溫程序?qū)18:1t12/13/14的分離效果也更好。樣品濃度對C18:2脂肪酸分離效果的影響較小(圖6)，但是含量較低的脂肪酸如C18:2c9t12和C18:2t11c15在5倍稀釋液時(shí)峰高水平接近基線，很難鑒定。綜上所述，原液的C18:1脂肪酸分離效果最差，5倍稀釋液對C18:1脂肪酸分離效果最好，但是對C18:2脂肪酸分離效果最差。而2倍稀釋液的分離效果最均勻，對C18:1脂肪酸和C18:2脂肪酸均可以很好地分離。

3 討 論

3.1 溫度程序?qū)θ闃覥18脂肪酸分離效果的影響

眾所周知，由于脂肪酸的碳鏈長度、雙鍵數(shù)目、幾何異構(gòu)體、官能團(tuán)等的不同，在GC分析時(shí)其溶出溫度不同。已知C18脂肪酸的同分異構(gòu)體對于色譜柱溫度非常敏感，幾攝氏度的差異就可能導(dǎo)致某些順、反式脂肪酸丟失或與其他同分異構(gòu)體重疊出峰[11]。因此，GC色譜柱的溫度程序?qū)18脂肪酸的分離程度有重要影響。目前，在175 ℃的溫度平臺保持27 min是最常用的C18脂肪酸溶出溫度，該溫度平臺能夠很好地分離出絕大部分的C18脂肪酸同分異構(gòu)體，但對C18:1t6～t11脂肪酸分離效果不夠理想。研究指出，將色譜柱的溫度從175 ℃降低至163 ℃、150 ℃[7]甚至120 ℃[5]，可以改善C18:1t6～t11的分離效果，而使用170 ℃等溫程序，即在170 ℃保持75 min也能夠改善C18脂肪酸同分異構(gòu)體的分離效果[8]。本試驗(yàn)對常用的175 ℃升溫程序、低溫條件下的150 ℃升溫程序和170 ℃等溫程序的比較表明，C18:1脂肪酸的分離效果受溫度程序影響更明顯，尤其是C18:1t6～t11、C18:1t12/13/14、C18:1c15、C18:1t15等同分異構(gòu)體，且不同溫度程序的影響不同。在三種溫度程序中，150 ℃升溫程序?qū)18:1t6～t11同分異構(gòu)體的分離效果最好，且該程序能夠分離出C18:1c15；175 ℃升溫程序和170 ℃等溫程序不能很好地分離C18:1t9與C18:1t6/7/8，且存在C18:1t10和C18:1t11共同洗脫溶出的情況，但這兩個(gè)溫度程序均能夠?qū)18:1t12/13/14從C18:1c9溶出，而后者還能從C18:1c9中分離出C18:1t15。上述結(jié)果與Kramer等[7]對不同溫度程序分離效果的比較結(jié)果相同，說明溫度程序是影響C18:1脂肪酸分離效果的重要因素，同時(shí)也表明很難有一種完美的溫度程序來實(shí)現(xiàn)所有C18:1脂肪酸的理想分離，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的程序溫度，或者將多種溫度程序相結(jié)合，尤其是將175 ℃升溫程序和150 ℃升溫程序相結(jié)合，可以獲得絕大部分C18:1同分異構(gòu)體的良好分離。鑒于不同溫度程序主要影響C18:2脂肪酸的出峰順序，所以在脂肪酸分離中，可以不考慮溫度程序?qū)18:2脂肪酸分離效果的影響。

3.2 樣品濃度對乳樣C18脂肪酸分離效果的影響

本實(shí)驗(yàn)室長期的脂肪酸分析實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，同樣的溫度條件下，有些樣品的C18:1脂肪酸尤其是t6～t11同分異構(gòu)體能夠分離良好，而有些樣品的分離效果卻很差，我們認(rèn)為可能與樣品本身的脂肪含量或某些脂肪酸含量高低有關(guān)?；诖?，本試驗(yàn)比較了不同溫度條件下樣品濃度對C18脂肪酸分離效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，樣品濃度影響乳樣中C18脂肪酸的分離效果，且C18:1尤其是C18:1t6～t11脂肪酸的分離效果隨著樣品濃度降低而改善，這一結(jié)果與早期Wolff和Bayard[11]報(bào)道中有關(guān)C18:1t15分離時(shí)應(yīng)降低進(jìn)樣量和樣品濃度，以防止其被過高的C18:1c9峰所覆蓋的觀點(diǎn)一致。在本試驗(yàn)樣品處理?xiàng)l件下，鑒于原液的分離效果較差而5倍稀釋液會導(dǎo)致一些含量過低的脂肪酸消失或峰高接近基線，推薦在用乳樣制備GC分析樣品時(shí)，可在本研究所用方法的提取步驟后再增加一步2 mL正己烷提取，這樣，相當(dāng)于使用了本研究中的2倍稀釋液。但考慮到不同乳樣乳脂特性差異較大，分析時(shí)還應(yīng)根據(jù)樣品特性首先確定適宜的分析濃度，以既保證各種同分異構(gòu)體的良好分離、又保證較低含量脂肪酸能夠有足夠的峰高為宜，或者采用多個(gè)樣品濃度相結(jié)合的方法也可以完善乳樣脂肪酸的分析結(jié)果。

4 結(jié) 論

乳樣GC分析中，色譜柱的溫度程序主要影響C18:1脂肪酸的分離效果和C18:2脂肪酸的出峰順序，且各具優(yōu)勢。降低樣品濃度可以改善C18:1脂肪酸的分離效果，但濃度過低會造成一些含量過低的脂肪酸丟失。綜合而言，按本研究的提取法對乳樣進(jìn)行2倍稀釋，并根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康牟捎枚喾N溫度程序相結(jié)合的方法，可實(shí)現(xiàn)乳樣C18脂肪酸的理想分離。