孫 毅 戴宗浩 彭夢華 葉俊華 徐 黎 劉占斌

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)(2.公安部南昌警犬基地，南昌 330100)

鉤端螺旋體(Leptospiraspp.簡稱鉤體)是一種極難培養(yǎng)且生長緩慢的需氧型革蘭陰性螺旋體原蟲[1],種類很多，可分為致病性和非致病性鉤端螺旋體兩大類。致病性鉤端螺旋體能導(dǎo)致人和動物患鉤端螺旋體病(Leptospirosis，簡稱鉤體病)。鉤體病是在世界各地都廣泛流行的一種人畜共患病，中國絕大多數(shù)地區(qū)都有不同程度的流行，對人畜健康造成很大危害，是中國重點(diǎn)防治的傳染病之一。鼠和嚙齒動物是其主要傳染源，家畜，特別是豬，犬，牛等是鉤體非常重要的儲存宿主和傳染源[2]。動物中, 犬鉤端螺旋體的感染率較高，大多呈隱性感染，鉤體在腎臟中長期存在，通過尿液持續(xù)向外排菌[3]。鉤體病在工作犬群中時(shí)有發(fā)生，影響工作犬的繁殖、訓(xùn)練與使用，經(jīng)調(diào)查，該病的發(fā)生與該地帶菌鼠關(guān)系密切，因此我們在江西某些養(yǎng)犬場通過捕捉褐家鼠(Rattusnorvegicus)來進(jìn)行鉤端螺旋體的分離培養(yǎng)，菌株的純化，并進(jìn)行PCR檢測以探明感染源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物來源：鉤端螺旋體的儲存宿主動物褐家鼠是通過捕鼠籠在江西某些犬場大量捕捉，共捕獲約20只；金黃地鼠16只，雌雄各8只，4周齡，體質(zhì)量在30～40 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證： SCXK(京)2016-0006)。

1.1.2主要儀器：GenAmp PCR儀購自Applied Biosystems公司；DYY-Ⅲ-12B電泳儀購自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司。

1.1.3主要試劑：核酸提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Taq DNA酶Mix和500 bp DNA Marker購自TaKaRa公司；瓊脂糖和染色劑，磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、兩性霉素B等藥物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；EMJH培養(yǎng)基購自吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1病料的采集：本實(shí)驗(yàn)采用背部解剖褐家鼠[2]取腎臟的方法，無菌操作摘取雙側(cè)腎臟；

1.2.2鉤端螺旋體的培養(yǎng)及觀察：將上述腎臟組織剪成米粒大小分別接種于3 mL EMJH培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)管置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周取一次培養(yǎng)物制片(取5 μL培養(yǎng)液置于載玻片上，蓋上蓋玻片)，用暗視野顯微鏡觀察有無鉤端螺旋體生長，如有，則接種于新鮮培養(yǎng)基中。如無生長，繼續(xù)培養(yǎng)觀察60 d，仍無菌生長作為陰性處理。

1.2.3鉤端螺旋體的純化：由于鉤體生長緩慢，培養(yǎng)時(shí)間較長，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，因此不論是從尿液、血液還是臟器中分離鉤體，難免會被污染。若鏡檢發(fā)現(xiàn)暗視野中全是雜菌，并未發(fā)現(xiàn)有鉤體生長的培養(yǎng)物，我們選擇棄之。對于污染輕的培養(yǎng)物，即一個(gè)暗視野中能分辨出有鉤體生長，可以采用以下方法純化：

(1)藥物純化：雖然EMJH培養(yǎng)基中添加了5 氟尿嘧啶，還是會有雜菌生長。可以添加以下幾種藥物，能有效殺死或抑制雜菌生長，而對鉤端螺旋體生長無影響，磺胺甲惡唑 400 μg/mL，甲氧芐啶 200 μg/mL，兩性霉素B 50 μg/mL[4]，使用0.22針頭式過濾器過濾，并儲存于-20 ℃保存，按1∶10的比例加到EMJH培養(yǎng)基中混勻使用。

(2)生物過濾法[2]：將污染有雜菌的鉤端螺旋體培養(yǎng)物1 mL接種于50～80 g金黃地鼠腹腔內(nèi)，一般在1～2 h內(nèi)以無菌操作采集心血，2～3滴血液到培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)可得到純的鉤端螺旋體。

1.2.4引物設(shè)計(jì)和DNA提取:通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[5]得到引物序列詳細(xì)信息見表1，將該引物序列于NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST進(jìn)行驗(yàn)證，以確保引物具有高度特異性為目的，將鉤端螺旋體基因引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 引物名稱、序列及擴(kuò)增片段Table 1 The names，sequences and amplification fragments of the primers

對純培養(yǎng)分離菌株、感染鉤體死亡的金黃地鼠的腎臟組織分別用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒按提示抽提基因組DNA。

1.2.5PCR擴(kuò)增及基因序列鑒定:以純培養(yǎng)分離菌株和感染鉤體死亡的金黃地鼠的腎臟組織染色體DNA為模板, 擴(kuò)增其鉤體外膜脂蛋白LipL32基因片段。

PCR反應(yīng)體系：DNA 1.5 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，Taq mix 酶12.5 μL，水9 μL，總體積25 μL。

PCR反應(yīng)條件：第一個(gè)循環(huán)包括94 ℃ 3 min，63 ℃ 1.5 min，72 ℃ 2 min，接下來的29個(gè)循環(huán)包括94 ℃ 1 min，63 ℃ 1.5 min，72 ℃ 2 min，最后72 ℃延伸10 min[6]。

反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測PCR產(chǎn)物，在紫外燈下觀察, 使用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將PCR陽性的純培養(yǎng)菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.6動物感染實(shí)驗(yàn):對28 ℃恒溫箱純培養(yǎng)的菌株，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度約為107條/mL。分別取菌液腹腔注射8只4周齡，體質(zhì)量30～40 g的金黃地鼠, 1.5 mL/只, 接種后觀察并記錄發(fā)病死亡情況。無菌操作從死亡的金黃地鼠肝臟、腎臟分離接種菌, 剖解觀察病變。對照組金黃地鼠注射同劑量的無菌EMJH培養(yǎng)基。

2 結(jié)果

2.1 鉤端螺旋體的形態(tài)學(xué)觀察

通過褐家鼠腎臟接種培養(yǎng)及后期菌株的純化最終從褐家鼠腎臟中純培養(yǎng)出一株鉤端螺旋菌。在暗視野顯微鏡下觀察(見圖1)，可看到鉤體的一端或兩端彎曲成鉤狀為其特點(diǎn)，呈C、S形，鉤端螺旋體運(yùn)動活潑，其運(yùn)動方式主要是沿著長軸旋轉(zhuǎn)，菌體中央部分較僵直，兩端比較柔軟，扭曲運(yùn)動。

圖1 400倍暗視野顯微鏡下觀察到的鉤端螺旋體Fig.1 Leptospira observed under a ×400dark field microscope

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

用鉤端螺旋體的特異性引物對純培養(yǎng)分離菌株和腎臟組織提出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能等得到331 bp的特異性條帶(見圖2)。

圖2 特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果注：M:500 bp Marker 1：菌液DNA 2：腎臟組織DNA 3：陰性對照Fig.2 Results of specific PCRNote: M: 500 bp Marker 1: bacterial solution DNA2: kidney tissue DNA 3: negative control

將純培養(yǎng)分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物送去生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測序，將測序的結(jié)果通過NCBI的BLAST序列比對，經(jīng)核苷酸序列測定分析證實(shí)上述序列與鉤端螺旋體菌FDAARGOS_203基因序列 (GenBank登錄號:CP020414.2) 同源性為100%，證明所分離到的菌是鉤端螺旋體菌。

2.3 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，金黃地鼠在攻毒3 d后陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病癥狀，表現(xiàn)為高熱、全身顫抖、精神不振、食欲減退，第4至5天發(fā)現(xiàn)金黃地鼠陸續(xù)死亡，從死亡金黃地鼠肝臟、腎臟均能分離到接種菌，剖解死亡的金黃地鼠,可見皮膚黃疸(見圖3)、肺出血(見圖4)、肝臟變性壞死(見圖5)、腎腫大，出血(見圖6)。對照組金黃地鼠全部健活。

圖3 A圖為健康鼠皮膚黏膜，B圖為感染鉤體死亡的鼠皮膚黏膜黃疸癥狀Fig.3 The picture A is the skin mucosa of healthy rats, and the picture B is the symptoms of jaundice in the skin of rats infected with leptospirosis

圖4 肺臟出血Fig.4 Lung bleeding

圖5 肝臟變性壞死Fig.5 Liver degeneration and necrosis

圖6 腎臟腫大、充血Fig.6 Kidney enlargement, congestion

3 討論

我國鉤端螺旋體病疫區(qū)分布廣泛，主要分布在北緯 25°～35°，東經(jīng) 100°～129°之間，該區(qū)域也是長江流域的一些省份[7]，由于該菌菌型復(fù)雜，據(jù)1986年國際微生物學(xué)會統(tǒng)計(jì)，全世界已發(fā)現(xiàn)的鉤體共有 23個(gè)血清群，200個(gè)血清型，各地流行種類和分布存在極大的差異性，同時(shí)由于各型之間缺乏交叉免疫，導(dǎo)致該病的診斷和預(yù)防具有一定的區(qū)域特異性。江西省作為鉤體病的老疫區(qū)，每年的鉤體病發(fā)病率遠(yuǎn)高于全國平均發(fā)病率[6]。污染的水源以及帶菌的黑線姬鼠、黃毛鼠、褐家鼠等嚙齒類動物等[8]是重要的感染源。金黃地鼠(Golden hamster;Mesocricetusauratus)是鉤端螺旋體試驗(yàn)比較理想的敏感動物，特別是對各群(型)致病性鉤端螺旋體均具有一定的敏感性。解剖檢查亦可見到比較明顯的肉眼病變，一般以4～6周齡(20～50 g)的金黃地鼠為佳[2]，故本實(shí)驗(yàn)研究選擇金黃地鼠作為檢測鉤端螺旋體致病性的易感動物。

本實(shí)驗(yàn)我們以分離到江西地區(qū)本地鉤端螺旋體菌株為出發(fā)點(diǎn)，通過對鉤端螺旋體菌的儲存宿主褐家鼠進(jìn)行腎臟分離培養(yǎng)，污染菌株的純化，形態(tài)學(xué)觀察以及PCR基因測序等試驗(yàn)對該病菌進(jìn)行鑒定，證實(shí)我們培養(yǎng)純化出一株江西地區(qū)的鉤端螺旋體菌，通過鉤端螺旋體的易感動物金黃地鼠進(jìn)行動物回歸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，金黃地鼠出現(xiàn)臨床癥狀，從死亡金黃地鼠肝臟、腎臟均能分離到接種菌，因此我們得出的結(jié)論是：從江西地區(qū)鼠源中分離到一株鉤端螺旋體菌且具有致病性。家鼠感染鉤體后發(fā)病輕微呈慢性帶菌狀態(tài)，而金黃地鼠作為鉤體感染敏感動物表現(xiàn)為急性發(fā)病且致死。表明該病原能影響動物健康狀況。同時(shí)，由于鉤體能感染人類，病菌入侵腎臟、肺和心臟可危及生命，是一種要引起大家重視的人畜共患菌，因此，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行病原的調(diào)查和排除是非常重要和必要的[9]。

鉤端螺旋體病對于犬的安全隱患很大，該地區(qū)犬場時(shí)有犬鉤端螺旋體病的發(fā)生，分離到的鉤體致病力強(qiáng)，表明該犬場中感染鼠作為本病的重要傳染源，因此開展滅鼠是預(yù)防犬發(fā)生本病的重要措施，同時(shí)，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，合理調(diào)配營養(yǎng)，規(guī)劃犬舍，適當(dāng)運(yùn)動，增強(qiáng)犬的體質(zhì)，也是重要預(yù)防措施。此外，犬舍的建設(shè)要干燥、朝陽及消毒，保持犬舍干燥，充分利用陽光、干燥等方式殺滅環(huán)境中的鉤體，以減少鉤端螺旋體生存的條件[10]。

本次研究通過對鉤端螺旋體的分離、培養(yǎng)、純化等方法的掌握，為后期分離野生鼠或患鉤體病的犬身上的鉤端螺旋體菌株累積了寶貴的經(jīng)驗(yàn)，也為后期建立江西地區(qū)鉤端螺旋體菌株的發(fā)病模型提供菌源奠定基礎(chǔ)。