李進鵬 梅 璐 王效聰 秦珍珍 張 晗 鄭鵬遠

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，鄭州大學(xué)馬歇爾醫(yī)學(xué)研究中心，鄭州 450000)

在世界范圍內(nèi)，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的患病率正在上升，2018年全球平均發(fā)病率大約為25%[1]。它是一種復(fù)雜的疾病，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)和相關(guān)的肝硬化[1-2]。其中，NASH是NAFLD危及生命的階段的轉(zhuǎn)折點[3]。NASH發(fā)生肝纖維化的風險增加，肝纖維化可發(fā)展為肝硬化、肝細胞癌和終末期肝病[4]。值得注意的是，目前NASH的患病率已高達全球人口的5%，但仍缺乏有效的治療手段[3]。因此，積極防治NAFLD具有重要的臨床意義。

FXR是一種可被膽汁酸激活的受體，主要存在于腸道、肝臟、腎臟等器官中[5]，其在糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、膽汁酸等代謝中起重要作用[6-7]。正如Amano等[8]和Schmitt 等[9]報道一樣，F(xiàn)XR被拮抗或者缺失，將會加重糖脂代謝紊亂，引起肝臟脂肪變性，甚至纖維化。目前FXR激動劑已應(yīng)用于臨床中NAFLD的治療，表現(xiàn)出一定的效果[10]。

目前許多關(guān)于NAFLD的相關(guān)研究仍需要依賴于動物模型，以往研究關(guān)于NAFLD的常見動物模型有ob/ob小鼠、LDLr-/-小鼠、ApoE-/-小鼠等[11]。本實驗以高脂飲食誘導(dǎo)FXR-/-小鼠建立NAFLD，為本課題組下一步研究聯(lián)合益生菌靶向激動腸道FXR以改善高脂飲食小鼠的NAFLD提供了必備條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：6只(3雄3雌)FXR+/-小鼠購買于賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0003，品系名C57BL/6-Nr1h4 tm1cyagen。經(jīng)過3代繁殖，第3代得到FXR-/-小鼠30只(17雄13雌)。20只6周齡C57BL/6野生型雄鼠購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。實驗經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會批準。

1.1.2試劑和儀器:輻照滅菌維持飼料和輻照滅菌楊木刨花墊料,江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司，蘇飼證(2014)01008；45%高脂飼料(蛋白質(zhì)20kcal%，碳水化合物35 kcal%，脂肪45 kcal%)，北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號SCXK(京)2014-0004；胰島素溶液，江蘇萬邦生物醫(yī)藥集團有限責任公司[國藥準字：H10890001]；血清指標(TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、TBA)試劑檢測盒(深圳庫貝爾生物科技股份有限公司)；引物(蘇州金唯智生物科技有限公司)；總RNA抽提試劑TRIzol試劑(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace? qPCR RT Kit(東洋紡生物科技有限公司)；RT-PCR試劑盒QuantiNova SYBR Green PCR Kit(凱杰生物技術(shù)有限公司)；HE染色試劑盒(生工生物工程股份有限公司)；自動生化分析儀(深圳庫貝爾生物科技股份有限公司)；血糖儀和LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)；全自動脫水機、組織石蠟包埋機、輪轉(zhuǎn)式切片機、攤片機、烘片機(Leica，德國)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組:實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。從20只6周齡C57BL/6雄鼠中隨機選取12只，分為2組，每組6只，記為ND(WT)組和HFD(WT)組。從17只6周齡FXR-/-雄鼠中隨機選取12只，分為2組，每組6只，記為ND(FXR-/-)組和HFD(FXR-/-)組。

1.2.2建立實驗?zāi)Ｐ? ND組給予輻照滅菌維持飼料喂養(yǎng)12周，HFD組給予45%高脂飼料喂養(yǎng)12周。實驗小鼠均飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，溫度22～24 ℃，濕度65%～70%，自由飲水和進食，白晝-黑夜12 h循環(huán)。喂養(yǎng)過程中注意觀察小鼠毛發(fā)、精神狀態(tài)等一般情況有無異常，每周記錄一次小鼠體質(zhì)量變化。小鼠處死前1周行腹腔注射胰島素耐量試驗(insulin tolerance test, ITT)和腹腔注射葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)。處死后留取標本。

1.2.3實驗操作

ITT：實驗前小鼠禁食12 h。胰島素溶液按照75U/kg體質(zhì)量劑量進行腹腔注射。血糖儀分別于0、15、30、60、90、120 min檢測小鼠血糖。

IPGTT：實驗前小鼠禁食12 h。20%葡萄糖溶液按照10 mL/kg劑量進行腹腔注射。血糖儀分別檢測0、15、30、60、90、120 min時間點血糖。

血清指標檢測：采用自動生化分析儀和檢測試劑盒測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、TBA等指標。

實時熒光定量PCR：TRIzol試劑提取小鼠肝臟總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

HE染色：取適量4%多聚甲醛固定好的小鼠肝臟，經(jīng)脫水、包埋、切片、攤片、撈片、烘片等步驟依次處理后，采用HE染色試劑盒進行染色。顯微鏡下觀察肝臟脂肪變性程度。

肝臟脂滴的平均數(shù)量和平均大?。篐E染色完成后，電子顯微鏡拍照。利用Image J軟件處理HE圖片，導(dǎo)出數(shù)據(jù)進一步分析。具體如參考文獻所示[12]。

1.3 統(tǒng)計方法

利用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用ANOVA統(tǒng)計方法。其中P<0.05，P<0.01。作圖采用GraphPad Prism 8.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量、ITT、IPGTT、IPGTT曲線下面積及肝臟指數(shù)水平改變

與ND(WT)組相比，ND(FXR-/-)組小鼠體質(zhì)量變化無差異。HFD(WT)組和HFD(FXR-/-)組小鼠體質(zhì)量自第3周開始，體質(zhì)量出現(xiàn)顯著增加(P<0.01)(圖1A箭頭所指)，而HFD(WT)組和HFD(FXR-/-)組小鼠體質(zhì)量無差異(圖1A)。在ITT中，ND組小鼠血糖下降最低值出現(xiàn)在30 min左右，HFD(WT)組和HFD(FXR-/-)組小鼠表現(xiàn)出明顯胰島素抵抗，注射胰島素后，其血糖下降最低值出現(xiàn)在60～75 min左右，其中HFD(FXR-/-)組小鼠各時間點血糖均高于HFD(WT)組(P<0.05)(圖1B)。在IPGTT中，HFD(FXR-/-)組小鼠表現(xiàn)出極其嚴重的糖耐量受損，IPGTT曲線下面積提示HFD(FXR-/-)小鼠曲線下面積高于HFD(WT)組(P<0.01)(圖1C和圖1D)。為了觀察小鼠肝臟大小變化情況，我們計算了小鼠肝臟指數(shù)(肝臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)，各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(圖1E)。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量、ITT、IPGTT、IPGTT曲線下面積及肝臟指數(shù)水平注：ITT，胰島素耐量試驗；IPGTT，腹腔注射葡萄糖耐量試驗。*P<0.05，**P<0.01Fig.1 Body weight, ITT, IPGTT, the area under curve of IPGTT and liver index in the different groups of miceNote:ITT, insulin tolerance test; IPGTT, intraperitoneal glucose tolerance test. *P<0.05, **P<0.01

2.2 小鼠血清血脂水平及肝功能變化

與ND(WT)組相比，HFD(WT)組小鼠血清TC、TG和LDL-C含量均明顯增加(P<0.01)。相比HFD(WT)組，HFD(FXR-/-)組小鼠血清TC、TG和LDL-C含量出現(xiàn)顯著性升高(P<0.01)(圖2 A、圖2B和圖2C)。與ND(WT)組相比，ND(FXR-/-)組小鼠HDL-C含量無差異，HFD(WT)組小鼠血清HDL-C含量降低(P<0.05)。與HFD(WT)組相比，HFD(FXR-/-)組小鼠血清HDL-C含量顯著性升高(P<0.01)(圖2D)。與ND(WT)組相比，ND(FXR-/-)組和HFD(WT)組小鼠血清ALT含量無變化，HFD(FXR-/-)組小鼠血清ALT含量約為HFD(WT)組2倍(P<0.01)(圖2E)。ND(WT)組和HFD(WT)組小鼠血清AST含量無差異。相比HFD(WT)組，HFD(FXR-/-)組小鼠血清AST含量上升(P<0.05)(圖2F)。

2.3 小鼠肝臟炎癥因子、FXR下游基因及清道夫受體B族1型(scavenger receptor type-B1, SR-B1)表達水平

與ND(WT)組相比，HFD(WT)組小鼠肝臟炎癥因子TNF-α和TLR4相對表達量無差異。與HFD(WT)組小鼠相比，HFD(FXR-/-)組小鼠TNF-α和TLR4相對表達量明顯增加，分別約為HFD(WT)組的2.5倍和15倍(P<0.01)(圖3A和圖3B)。與ND(WT)組相比，ND(FXR-/-)組小鼠肝臟SHP表達量明顯下降，而HFD(WT)組小鼠肝臟SHP表達量增加(P<0.01)。和HFD(WT)組相比，HFD(FXR-/-)組小鼠肝臟SHP表達量下降更明顯(P<0.01)(圖3C)。與ND(WT)組相比，ND(FXR-/-)組小鼠肝臟CYP7A1表達量明顯增加(P<0.01)，HFD(WT)組小鼠肝臟CYP7A1表達量無變化。同樣的，HFD(FXR-/-)組小鼠肝臟CYP7A1表達量為HFD(WT)組的5倍(圖3D)。檢測血清中膽汁酸含量，與ND(WT)組相比，HFD(WT)組小鼠血清膽汁酸含量無差異。ND(FXR-/-)組小鼠血清膽汁酸含量約為ND(WT)組的9倍，HFD(FXR-/-)組小鼠血清膽汁酸含量約為HFD(WT)組的27倍(P<0.01)(圖3E)。與HFD(WT)組相比，HFD(FXR-/-)組小鼠肝臟SR-B1相對表達量下降，約為HFD(WT)組的1/4(P<0.01)(圖3F)。

圖2 各組小鼠血清指標水平注：*P<0.05，**P<0.01Fig.2 The levels of serum index in the different groups of miceNote:*P<0.05, **P<0.01

圖3 各組小鼠肝臟炎癥因子、FXR下游基因及清道夫受體B族1型(SR-B1)表達水平注：TNF-α，腫瘤壞死因子α；TLR4，Toll樣受體4；SHP，小分子異源二聚體；CYP7A1，膽固醇7α-羥化酶；SR-B1，清道夫受體B族1型。*P<0.05，**P<0.01Fig.3 Expression of liver inflammatory factors, downstream genes of FXR and scavenger receptor B group 1 (SR-B1) in the different groups of miceNote: TNF-α, tumor necrosis factor α; TLR4, Toll-like receptor 4; SHP, small heterodimer partner; CYP7A1, cholesterol 7α-hydroxylase; SR-B1, scavenger receptor B family type 1.*P<0.05, **P<0.01

2.4 小鼠肝臟HE染色病理和脂滴分析

ND(WT)組和ND(FXR-/-)組小鼠鏡下肝臟結(jié)構(gòu)正常。 HFD(WT)組小鼠鏡下肝索結(jié)構(gòu)排列紊亂，整個肝小葉散在出現(xiàn)脂肪空泡，并胞內(nèi)空泡變性程度近中央靜脈處較輕，未見炎細胞浸潤。HFD(FXR-/-)組小鼠鏡下肝索排列紊亂，肝細胞混濁腫脹，視野內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡，并空泡變性程度近中央靜脈處越明顯，偶見炎細胞浸潤(圖4)。利用Image J軟件，我們對HE圖片進行了量化處理，計算了相同視野下脂滴的平均數(shù)量和平均大小，并對數(shù)據(jù)進一步處理。結(jié)果表明，在相同視野下，HFD(FXR-/-)組小鼠脂滴數(shù)量明顯多于HFD(WT)組(P<0.01)(表2和圖5A)。HFD(WT)組小鼠脂滴中以200～400大小范圍為主，而HFD(FXR-/-)組小鼠>800大小范圍的脂滴占據(jù)了60%左右(圖5B)。這些結(jié)果表明，在相同高脂飲食條件下，F(xiàn)XR-/-小鼠肝臟脂肪病變更為嚴重，脂滴以大泡病變?yōu)橹鳌?/p>

圖4 小鼠肝臟HE染色注：放大倍數(shù) ×200Fig.4 Mice liver HE stainingNote:magnification ×200

表2 肝臟脂滴平均數(shù)量Table 2 The average number of liver lipid droplets

圖5 肝臟脂滴數(shù)量和不同大小脂滴所占比例注：數(shù)據(jù)來源于Image J軟件分析處理肝臟HE圖片結(jié)果Fig.5 Calculation of the average number of liver lipid droplets and average droplet sizeNote: The data comes from the analysis results of liver HE images by Image J software

3 討論

FXR在體內(nèi)主導(dǎo)膽汁酸代謝，同時也是糖類、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝的關(guān)鍵因素[13-14]。早在2000年，Sinal等[15]已經(jīng)證實FXR-/-小鼠能夠誘導(dǎo)肝臟膽汁酸水平升高和肝臟損傷，進而引起肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化。本文引文中提到的ob/ob小鼠，是作為飽食模型，促進小鼠形成NAFLD。LDLr-/-小鼠和ApoE-/-小鼠是通過影響脂蛋白合成或者分泌以誘導(dǎo)NAFLD的形成[11]。這些模型都是通過某一方面因素干預(yù)NAFLD的形成。而本實驗選取FXR-/-小鼠，是因為FXR的缺失能夠?qū)е绿侵x紊亂、膽汁酸升高、肝臟脂肪變性形成[13-15]。換句話說，小鼠體內(nèi)FXR被激動之后，可以緩解這些代謝紊亂，進而減輕NAFLD。

在Cariou等[16]和Ma等[17]實驗中，通過高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術(shù)實驗證實，F(xiàn)XR-/-小鼠出現(xiàn)嚴重的糖耐量受損和外周胰島素抵抗，反映為對外周葡萄糖處理能力減弱。我們研究發(fā)現(xiàn)，HFD(FXR-/-)組小鼠表現(xiàn)出極其明顯的胰島素抵抗及糖耐量受損，ITT中血糖下降緩慢且不明顯。IPGTT中各時間點血糖明顯升高且血糖峰值后移，IPGTT曲線下面積明顯高于其他組小鼠。HFD(WT)組小鼠雖也表現(xiàn)出胰島素抵抗及糖耐量受損，但程度遠不如HFD(FXR-/-)組。

同時我們也檢測了血脂譜及肝功能變化，TC、TG、LDL-C、AST及ALT變化和預(yù)期相符，HFD(FXR-/-)組小鼠含量均高于其他組，表現(xiàn)出明顯的脂質(zhì)代謝紊亂和肝功能受損。值得關(guān)注的是HDL-C含量的變化，HDL-C通常被認為是一種保護性因子，可將膽固醇從肝外組織轉(zhuǎn)運到肝臟進行代謝，再由膽汁排出體外，被稱為“好膽固醇”[18-19]。但在本實驗中，HFD(FXR-/-)組小鼠的HDL-C反而明顯增加。有研究表明，高脂飲食的FXR-/-小鼠肝臟清道夫受體B族1型(SR-B1)水平降低，而SR-B1在HDL-C轉(zhuǎn)運中起重要作用[15，19-20]。我們考慮在FXR-/-小鼠中觀察到的血漿HDL-C水平升高是由于肝臟對HDL-C的選擇性攝取減少，并非HDL-C產(chǎn)生增多，這可能與SR-B1的表達下降有關(guān)。為此我們檢測了各組小鼠肝臟SR-B1表達情況，結(jié)果表明HFD(FXR-/-)組小鼠肝臟SR-B1相對表達量明顯下降，約為HFD(WT)組的1/5。

我們進一步檢測了肝臟炎癥因子指標，HFD(FXR-/-)組小鼠中TNF-α和TLR4相對表達量均明顯增加，肝臟炎癥明顯。值得注意的是，相比普通飲食，高脂飲食條件下C57BL/6小鼠肝臟炎癥水平并未增加。FXR在膽汁酸代謝中起主導(dǎo)作用，在肝臟中主要通過FXR→SHP→CYP7A1軸調(diào)節(jié)膽汁酸代謝[21]，因此我們檢測了肝臟SHP、CYP7A1的表達水平。ND(FXR-/-)組和HFD(FXR-/-)組小鼠中SHP表達量均出現(xiàn)下降，是因為在FXR-/-小鼠中SHP失去了上游靶基因FXR的激動。但HFD(FXR-/-)組小鼠SHP表達量下降更明顯，我們推測高脂飲食會進一步減弱FXR軸功能。CYP7A1受其上游靶基因FXR、SHP的負反饋調(diào)節(jié)，它是膽汁酸經(jīng)典合成通路的關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)機體膽汁酸合成[21-22]。CYP7A1變化趨勢與SHP相反。血清中膽汁酸含量也如預(yù)期結(jié)果，在FXR-/-小鼠中CYP7A1失去了上游靶基因控制后含量明顯增加，促進肝臟膽汁酸的合成，ND(FXR-/-)組和HFD(FXR-/-)組小鼠血清膽汁酸含量均明顯增加，但HFD(FXR-/-)組小鼠血清膽汁酸含量為ND(FXR-/-)組4倍，進一步證實高脂飲食對FXR軸功能的影響。

肝臟HE染色及脂滴分析結(jié)果顯示HFD(FXR-/-)組小鼠肝臟出現(xiàn)彌漫大泡性脂肪空泡，同時可觀察到間質(zhì)偶有炎癥細胞浸潤。這些變化與前文提到的糖脂代謝紊亂、肝臟炎癥、肝功能受損一起表明，高脂飲食誘導(dǎo)FXR-/-小鼠可引起糖脂代謝紊亂和肝臟脂肪變性。

雖然高脂飲食誘導(dǎo)FXR-/-小鼠表現(xiàn)出極其明顯的代謝紊亂和肝臟大空泡脂肪變性，符合NAFLD疾病特征。但仍存一定缺陷，比如FXR+/-小鼠的制備過程長(4～6個月)、花費較高(約3000～4000元/只)、FXR-/-小鼠繁殖周期長(本課題組繁殖長達8個月)。但FXR-/-小鼠的應(yīng)用，為進一步研究評價FXR激動劑對小鼠NAFLD的治療效果提供基礎(chǔ)。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)FXR-/-小鼠可導(dǎo)致其產(chǎn)生明顯的糖脂代謝紊亂、膽汁酸代謝異常、肝功能異常及肝臟脂肪變性。