王 吉 李曉波 王 洪 付 瑞 李 威 王淑菁 馮育芳 王莎莎 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

小鼠細(xì)小病毒(MMV)屬細(xì)小病毒科的細(xì)小病毒屬。核酸型為單股線狀DNA。對(duì)外界環(huán)境因素抵抗力強(qiáng)，極耐干燥。實(shí)驗(yàn)小鼠和野生小鼠是MMV的自然宿主，實(shí)驗(yàn)條件下可感染大鼠和倉(cāng)鼠[1]?？稍谏L(zhǎng)旺盛的大鼠胚細(xì)胞和小鼠胚細(xì)胞中生長(zhǎng)，并產(chǎn)生血凝素。MMV具有高度傳染性，主要通過糞便和尿液傳播，易感小鼠通過直接或間接接觸而感染,也可經(jīng)胎盤垂直傳播。MMV廣泛存在于實(shí)驗(yàn)小鼠和野生小鼠中，在世界范圍內(nèi)廣泛存在[1-3]。在我國(guó)小鼠群中也監(jiān)測(cè)到MMV的感染[4-6]。MMV不僅是白血病病毒種毒、連續(xù)移植小鼠腫瘤的一種極常見的污染物，同時(shí)MMV污染也是倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)生物制藥生產(chǎn)過程中的一大難題[1，7]。MMV是我國(guó)SPF等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原微生物之一[8]，同時(shí)也是ICLAS、FELASA等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中要求排除的病原微生物之一[9]。

為促進(jìn)我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)相關(guān)機(jī)構(gòu)檢測(cè)水平的整體提高，2018年由中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)組織，中國(guó)食品藥品檢定研究院依據(jù)ISO/IEC17043∶2010《合格評(píng)定能力驗(yàn)證的通用要求》運(yùn)作實(shí)施全國(guó)范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)小病毒(MMV)抗體檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃[10-12]。目的是通過組織實(shí)施能力驗(yàn)證了解我國(guó)目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)在實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)小病毒(MMV)抗體檢測(cè)方面的技術(shù)水平和能力。通過對(duì)各檢測(cè)機(jī)構(gòu)提交檢測(cè)結(jié)果的比較分析，來彌補(bǔ)我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢驗(yàn)中存在的不足、完善檢驗(yàn)檢測(cè)體系，達(dá)到促進(jìn)我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)技術(shù)水平的整體提高[11]。

1 材料與方法

1.1 能力驗(yàn)證計(jì)劃開展

開展驗(yàn)證的項(xiàng)目：實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)小病毒(MMV)抗體檢測(cè)；開展時(shí)間：2018年4月；驗(yàn)證代碼：NIFDC-PT-172；組織單位：中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)；計(jì)劃實(shí)施單位：中國(guó)食品藥品檢定研究院(以下簡(jiǎn)稱中檢院)[14-15]。

1.2 能力驗(yàn)證計(jì)劃的發(fā)布

本次能力驗(yàn)證計(jì)劃實(shí)施前6個(gè)月在全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)公開，面向全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)。國(guó)內(nèi)具備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)能力和資質(zhì)的所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室均可報(bào)名參加。并規(guī)定了能力驗(yàn)證時(shí)間及檢測(cè)結(jié)果反饋截至?xí)r間[14-15]。

1.3 能力驗(yàn)證主要實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)小病毒(MMV)抗體陽性血清、實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)小病毒(MMV)抗體陰性血清：本室凍存；小鼠細(xì)小病毒(MMV)抗原包被板：本室制備；羊抗小鼠IgG-HRP：KPL公司；商品化實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)小病毒(MMV)抗體ELISA試劑盒：國(guó)外某公司產(chǎn)品。

1.4 能力驗(yàn)證比對(duì)樣本的檢測(cè)及標(biāo)定

1.4.1此次比對(duì)實(shí)驗(yàn)需要3個(gè)樣本，編號(hào)分別為樣本1、樣本2、樣本3。3個(gè)樣本肉眼觀察性狀均應(yīng)為澄清、透明、無絮狀物的淡黃色液體[11，14-15]。

1.4.23個(gè)樣本按國(guó)標(biāo)ELISA方法測(cè)定后，用商品化ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行標(biāo)定。要求樣本1和樣本2為已知MMV抗體陽性樣本，樣本3為已知MMV抗體陰性樣本。ELISA按國(guó)標(biāo)要求進(jìn)行操作[8]，商品化試劑盒按說明書進(jìn)行操作[14-15]。

1.5 能力驗(yàn)證比對(duì)樣本的分裝及編號(hào)

取3個(gè)經(jīng)過標(biāo)定的樣本，各分裝100支，100 μL/支。外包裝均一致，樣本性狀顏色均一致。由實(shí)施單位將所有樣本進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，并記錄每支樣本編號(hào)和相對(duì)應(yīng)的結(jié)果[11，14]。

1.6 能力驗(yàn)證比對(duì)樣本的均一性測(cè)定

將2個(gè)陽性樣本(樣本1和樣本2)和1個(gè)陰性樣本(樣本3)分別分裝成100份，隨機(jī)各取15份用國(guó)標(biāo)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，要求樣本1小鼠細(xì)小病毒抗體A492≥0.6，樣本2小鼠細(xì)小病毒抗體0.6>A492≥0.2，樣本3小鼠細(xì)小病毒抗體A492<0.2。通過考察3個(gè)樣本的A值變化范圍和15支樣本的A492值的變異系數(shù)(相對(duì)偏差)來評(píng)價(jià)樣本的均一性[11，13-16]。

1.7 能力驗(yàn)證比對(duì)樣本的穩(wěn)定性測(cè)定

1)37 ℃穩(wěn)定性試驗(yàn)

3個(gè)比對(duì)樣本隨機(jī)各抽取15支，放置于37 ℃孵育箱，連續(xù)15 d，每天各取1支，凍存于-70 ℃，作為37 ℃穩(wěn)定性樣品[11，13-14，16]。

2)4 ℃穩(wěn)定性試驗(yàn)

3個(gè)比對(duì)樣本隨機(jī)各抽取15支，放置于4 ℃孵育箱，連續(xù)15 d，每天各取1支，凍存于-70 ℃，作為4 ℃穩(wěn)定性樣品[14]。

2組樣本均采用國(guó)標(biāo)ELISA方法測(cè)定各樣本A492值，通過考察3個(gè)樣本A492值變化范圍或計(jì)算3個(gè)樣本在2個(gè)不同溫度環(huán)境分別放置15 d 的A492值變異系數(shù)(相對(duì)偏差)，以評(píng)價(jià)樣本的穩(wěn)定性。

1.8 能力驗(yàn)證比對(duì)樣本的運(yùn)輸穩(wěn)定性測(cè)定[11]

將3個(gè)比對(duì)樣本，隨機(jī)各取3份于運(yùn)輸冷藏箱中存放，連續(xù)放置7 d，每天記錄箱內(nèi)溫度。第7天將樣品取出進(jìn)行檢測(cè)，樣本1小鼠細(xì)小病毒抗體A值應(yīng)為A492≥0.6，樣本2小鼠細(xì)小病毒抗體A值應(yīng)為0.6>A492≥0.2，樣本3小鼠細(xì)小病毒抗體A值應(yīng)為A492<0.2。

1.9 能力驗(yàn)證比對(duì)樣本的分發(fā)

將經(jīng)過均一性、穩(wěn)定性和運(yùn)輸穩(wěn)定性檢測(cè)均符合要求的比對(duì)樣本，分發(fā)給各報(bào)名參加比對(duì)單位。每個(gè)單位分發(fā)3個(gè)樣本。并由實(shí)施單位記錄不同單位相對(duì)應(yīng)的樣本編號(hào)，通過冷鏈保持低溫運(yùn)輸[14]。

1.10 本次能力驗(yàn)證檢測(cè)方法為ELISA方法[8]

1.11 結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

此次能力驗(yàn)證為定性檢測(cè)，樣本檢測(cè)結(jié)果以陰性(-)或陽性(+)來表示[13-16]。比對(duì)單位在規(guī)定截至日期內(nèi)反饋結(jié)果，并且3個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施單位分發(fā)樣本的預(yù)期結(jié)果均相符，判為滿意；比對(duì)單位未在截至日期內(nèi)反饋結(jié)果，或者比對(duì)樣本中有一個(gè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不相符，則判為不滿意[12-21]。

2 結(jié)果

2.1 33個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)參加此次能力驗(yàn)證計(jì)劃

由中檢院給每個(gè)機(jī)構(gòu)以“NIFDC-PT-172-編號(hào)”表示的1個(gè)代碼，對(duì)其說明反饋的結(jié)果及其評(píng)價(jià)均以代碼表示。

2.2 比對(duì)樣本的標(biāo)定

經(jīng)ELISA檢測(cè)的3個(gè)樣本通過商品化小鼠細(xì)小病毒(MMV)抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，符合率為100%。樣本1和樣本2為陽性，樣本3為陰性，結(jié)果見表1。

表1 比對(duì)樣本標(biāo)定結(jié)果Table 1 The calibration results of samples

2.3 能力驗(yàn)證比對(duì)樣本的均一性測(cè)定

樣本1和樣本2兩個(gè)陽性樣本A值范圍分別為0.673～0.819和0.374～0.511，其變異系數(shù)(相對(duì)偏差)分別為6.93%和9.46%。陰性樣本3的A值范圍為-0.008～0.007。3個(gè)樣本均符合能力驗(yàn)證樣本均一性要求。3個(gè)樣本A值結(jié)果見表2。

2.4 樣本的穩(wěn)定性測(cè)定[12]

結(jié)果顯示37 ℃穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣本1和樣本2兩個(gè)陽性樣本A值范圍分別為0.612～0.792和0.376～0.508，其變異系數(shù)(相對(duì)偏差)分別為7.78%和10.24%。陰性樣本3的A值范圍為-0.005～0.003，均符合樣本穩(wěn)定性要求。

4 ℃穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣本1和樣本2兩個(gè)陽性樣本A值范圍分別為0.657～0.866和0.376～0.508，其

表2 樣本均一性測(cè)定結(jié)果Table 2 The uniformity results of samples

變異系數(shù)(相對(duì)偏差)分別為7.78%和10.24%。陰性樣本3的A值范圍為-0.001～0.009，均符合樣本穩(wěn)定性要求。

3個(gè)樣本A值結(jié)果見表3。

表3 樣本穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果Table 3 The stability results of samples

2.5 樣本的運(yùn)輸穩(wěn)定性測(cè)定

連續(xù)7 d監(jiān)測(cè)比對(duì)樣本存放于運(yùn)輸冷藏箱溫度記錄結(jié)果及溫度變化曲線見表4及圖1。運(yùn)輸穩(wěn)定性樣本檢測(cè)結(jié)果見表5。

表4 運(yùn)輸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)溫度記錄結(jié)果Table 4 The temperature record results of transport stability test

圖1 運(yùn)輸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)溫度記錄曲線圖Fig.1 The temperature graph of transport stability test

表5 運(yùn)輸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of transport stability test

結(jié)果顯示3份樣本1的A492值均>0.6,3份樣本2的A值均為0.6>A492>0.2，3份樣本3的A492值均<0.2。3個(gè)樣本均符合樣本運(yùn)輸穩(wěn)定性要求。

2.6 參加能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室行業(yè)分布統(tǒng)計(jì)[12]

參加本次能力驗(yàn)證的有國(guó)家及省部級(jí)科學(xué)研究院，省、市級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)質(zhì)量中心、疾病預(yù)防控制中心等共33家檢測(cè)機(jī)構(gòu)，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6。

表6 參加實(shí)驗(yàn)室行業(yè)分布Table 6 The industry distribution of participating laboratory

2.7 參加能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室地區(qū)分布統(tǒng)計(jì)[12]

參加本次能力驗(yàn)證的33個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)覆蓋了國(guó)內(nèi)19個(gè)省/市/自治區(qū)。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表7。

表7 參加實(shí)驗(yàn)室所在地區(qū)分布Table 7 The regional distribution of participating laboratory

2.8 能力驗(yàn)證比對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果分析[12]

33個(gè)實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定時(shí)限內(nèi)均提交了樣本的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室代碼及其相對(duì)應(yīng)的樣本編號(hào)及其檢測(cè)結(jié)果見表8。

表8 33家單位反饋檢測(cè)結(jié)果一覽表Table 8 The list of test results from 33 units

續(xù)表8-1

續(xù)表8-2

從匯總結(jié)果看，33個(gè)實(shí)驗(yàn)室及檢測(cè)結(jié)果均為滿意，滿意率為100%。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的要求

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T14926.28-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠細(xì)小病毒檢測(cè)方法)[8]規(guī)定的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫酶試驗(yàn)(IEA)、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)[8]，與以往的能力驗(yàn)證計(jì)劃不同的是，考慮到不同檢測(cè)方法可能出現(xiàn)不同的結(jié)果，本次能力驗(yàn)證要求所有參加單位均采用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)[8]。從反饋的結(jié)果來看，提交結(jié)果的33家實(shí)驗(yàn)室均采用了ELISA檢測(cè)方法[8]，有1家單位同時(shí)還采用IFA方法進(jìn)行了結(jié)果驗(yàn)證，2種方法的檢測(cè)結(jié)果均為滿意。通過此單位采用ELISA和IFA 2種方法檢測(cè)均可得到滿意結(jié)果，同時(shí)結(jié)合2016年及2017年此單位也均采用上述兩種方法對(duì)其他兩種病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)并均得到滿意結(jié)果看：1)證明其中一種方法可以作為驗(yàn)證另一種方法的可靠技術(shù)手段；2)此家實(shí)驗(yàn)室兩種方法技術(shù)應(yīng)用均較成熟；3)此家實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)技術(shù)能力方面較強(qiáng)。

3.2 檢測(cè)試劑的選擇

從檢測(cè)試劑看，提交材料的33家單位中，有21家采用商品化ELISA試劑進(jìn)行檢測(cè)，并說明了試劑盒來源及批號(hào)。其中有2家實(shí)驗(yàn)室同時(shí)采用國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口兩種試劑進(jìn)行檢測(cè)，其余8家單位未表明試劑盒來源。不管是使用國(guó)內(nèi)檢測(cè)試劑，還是國(guó)外檢測(cè)試劑，或是未表明試劑來源的檢測(cè)試劑，反饋的結(jié)果看均為滿意。說明商品化檢測(cè)試劑質(zhì)量可靠，為我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制提供可靠的技術(shù)保障，同時(shí)也說明參加能力驗(yàn)證各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力可靠。同時(shí)從反饋的信息看，大家更傾向于選擇國(guó)外檢測(cè)試劑，但2018年從檢測(cè)結(jié)果看，國(guó)內(nèi)國(guó)外檢測(cè)試劑均能達(dá)到滿意結(jié)果。結(jié)合近幾年檢測(cè)結(jié)果看，不滿意結(jié)果中用國(guó)外檢測(cè)試劑的和用國(guó)內(nèi)檢測(cè)試劑單位占百分比相當(dāng)，所以從近幾年使用試劑和反饋結(jié)果看，檢測(cè)結(jié)果是否達(dá)到滿意，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)能力至關(guān)重要。

3.3 反饋結(jié)果分析

本次能力驗(yàn)證同樣加入了弱陽性樣本，并且采用隨機(jī)編號(hào)形式進(jìn)行隨機(jī)發(fā)放。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)放陽性、弱陽性和陰性樣本各1個(gè)[13-16，20]。弱陽性樣本的增加無疑增加了檢測(cè)難度，也更能檢驗(yàn)出各單位的檢驗(yàn)水平。從整個(gè)反饋結(jié)果看，各單位均能檢出弱陽性樣本，說明各單位在小鼠細(xì)小病毒檢測(cè)方面具備很強(qiáng)的檢測(cè)能力。

33家提交材料的單位中，有23家提交了報(bào)告，有29家提交了原始記錄，有19家同時(shí)提交了報(bào)告和原始記錄。從報(bào)告和原始記錄信息看，大部分原始記錄里體現(xiàn)了使用儀器及儀器編號(hào)、檢驗(yàn)依據(jù)等信息的記錄，而且部分實(shí)驗(yàn)室原始記錄記述相當(dāng)詳細(xì)完整。有6家實(shí)驗(yàn)室在報(bào)告及原始記錄里沒有提到檢驗(yàn)依據(jù)，有5家實(shí)驗(yàn)室沒有使用相關(guān)儀器信息。提示部分實(shí)驗(yàn)室需要完善報(bào)告及原始記錄的完整性。

按照國(guó)標(biāo)的要求，檢測(cè)為陽性的樣品需要用同一方法或不同方法進(jìn)行復(fù)檢，尤其是ELISA試驗(yàn)，影響結(jié)果因素較多，進(jìn)行復(fù)檢或平行樣本檢測(cè)很有必要，本次提供材料的33家實(shí)驗(yàn)室，有9家實(shí)驗(yàn)室做的較好，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用不同方法、不同的實(shí)驗(yàn)人員或不同來源試劑進(jìn)行了復(fù)檢，有的實(shí)驗(yàn)室用同一方法進(jìn)行了復(fù)檢，還有的實(shí)驗(yàn)室每個(gè)檢測(cè)樣本做了多個(gè)重復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)；但多數(shù)實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)樣本的單次檢驗(yàn)即判定了結(jié)果。雖然從提交檢測(cè)結(jié)果看，與預(yù)期結(jié)果一致。但是，從實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)程序來看，存在缺陷。因此建議沒有對(duì)陽性樣本進(jìn)行復(fù)核或者復(fù)檢的實(shí)驗(yàn)室在今后的實(shí)驗(yàn)過程，要做到對(duì)陽性檢測(cè)樣本進(jìn)行驗(yàn)證或復(fù)核，以保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。部分單位使用的檢測(cè)試劑未寫明來源或來源不清，檢測(cè)報(bào)告中應(yīng)寫明檢測(cè)試劑的來源及批號(hào)等信息，以保證檢測(cè)結(jié)果的溯源性。

從本次能力驗(yàn)證結(jié)果，并結(jié)合近年開展的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒檢測(cè)項(xiàng)目能力驗(yàn)證結(jié)果可以看出，通過開展能力驗(yàn)證活動(dòng)[13-16，20]，不僅促進(jìn)了我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力和檢測(cè)水平的整體提高，而且對(duì)于完善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢驗(yàn)檢測(cè)體系具有重要意義。