李育敏，闞麗娟，張水蘭，湯花梅，許曉清，熊丹，張秀明(深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣東深圳 518001)

按照ISO 15189: 2012要求和CNAS-CL02-A009《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[1]，定量檢測方法和程序的分析性能驗證應(yīng)包括抗干擾能力?！兑倚透窝撞《久撗鹾颂呛怂岫繖z測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》要求必須驗證的干擾物質(zhì)有三酰甘油、膽紅素、血紅蛋白和IgG。本研究參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)EP7-A2方案[2]，進(jìn)行系列干擾評價試驗，驗證血紅蛋白、三酰甘油、總膽紅素和總IgG對HBV DNA檢測的干擾，對存在干擾的物質(zhì)評價其濃度和干擾程度之間的關(guān)系，確定和量化干擾效應(yīng)，為臨床實驗室進(jìn)行分子診斷定量檢測方法和程序的分析干擾性能驗證提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 HBV DNA熒光定量PCR試劑盒(批號:2017012，湖南圣湘公司)；cobas?z480全自動熒光定量PCR分析儀(Roche公司)。

1.2配對差異試驗 參照EP7-A2方案，驗證干擾物是否對熒光定量PCR法測定HBV DNA存在干擾。

1.2.1樣本 廠家聲明三酰甘油≤3 000 mg/dL(34.0 mmol/L)、總膽紅素≤476.0 μmol/L、血紅蛋白≤2 g/dL和總IgG≤40 g/L對檢測結(jié)果無影響。收集三酰甘油、總膽紅素和總IgG濃度與廠家聲明接近以及溶血(檢測血紅蛋白濃度)且HBV DNA陰性的血清樣本作為干擾物，制備HBV DNA分析濃度在高、低2個水平(103和106IU/mL)的血清樣本作為測試樣本。配制方法：以三酰甘油為例，取HBV DNA濃度為105IU/mL、三酰甘油<1 mmol/L的血清樣本和三酰甘油濃度為34.0 mmol/L、HBV DNA陰性的血清樣本，按1∶100比例配制成三酰甘油濃度為34.0 mmol/L、HBV DNA分析濃度為103IU/mL的測試樣本(由于稀釋比例為1∶100，前者對后者血清樣本中三酰甘油濃度的影響可以忽略不計)；HBV DNA分析濃度為106IU/mL水平的測試樣本則選取108IU/mL的血清樣本以相同方法配制。其余干擾物配制同三酰甘油。對照樣本按同樣方法配制為HBV DNA分析濃度相同的血清樣本，不含血紅蛋白，僅含少量三酰甘油(<1 mmol/L)、總膽紅素(<6 μmol/L)，與測試樣本相比，所含干擾物濃度可忽略不計。但由于總IgG干擾樣本濃度較低(40 g/L)，而正常血清中IgG平均濃度約10 g/L，故對照樣本選取12 g/L的總IgG正常標(biāo)本，即約40 g/L的干擾樣本與12 g/L的對照樣本進(jìn)行比較。作為干擾物(三酰甘油、總膽紅素、血紅蛋白和總IgG)的血清均各選擇3個與廠家聲明的干擾濃度接近的臨床樣本，3個樣本均存在干擾作用再進(jìn)行劑量效應(yīng)試驗。所有實驗樣本均排除丙肝DNA陽性。

1.2.2測定流程 取HBV DNA分析濃度分別為103IU/mL和106IU/mL的2個血清樣本，每個樣本重復(fù)測定20次，得到均值和批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差(s)。確定最大允許干擾值(dmax)為國家衛(wèi)生和健康委員會臨檢中心室間質(zhì)評評價界限0.4(LOG值)，分別計算2個濃度水平的dmax/s，查附表得出2個濃度水平的重復(fù)次數(shù)(n)。測試樣本和對照樣本同批檢測，按重復(fù)次數(shù)測定。樣本檢測前校準(zhǔn)儀器，每天進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，質(zhì)控在控時數(shù)據(jù)可接受。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 計算測試樣本和對照樣本的測量均值間的差值，差值≤±0.4(LOG值)，符合廠家聲明。

1.3劑量效應(yīng)試驗 參照EP7-A2方案，對存在干擾的物質(zhì)確定干擾物濃度與干擾程度之間的關(guān)系(干擾效應(yīng))。

1.3.1樣本 高濃度干擾物樣本(H)選取高于廠商聲明濃度的病理血清樣本，低濃度干擾物樣本(L)選取正常平均濃度的血清樣本。高、低濃度干擾物樣本均檢測HBV DNA為陰性后制備成5個系列濃度(4L，3L+1H，2L+2H，1L+3H，4H)的干擾樣本。取HBV DNA濃度為105IU/mL和108IU/mL的血清和各濃度梯度的干擾樣本，配制HBV DNA分析濃度在103IU/mL和106IU/mL 2個水平的測試樣本，配制方法同配對差異試驗。

1.3.2測定流程 每個樣本重復(fù)測量3次，在1個分析批次內(nèi)完成檢測。

1.3.3數(shù)據(jù)分析 計算低濃度水平(4L)標(biāo)本的測量均值，各濃度水平的測定結(jié)果減去低濃度標(biāo)本的均值為干擾效應(yīng)。以干擾物濃度為x軸，以干擾效應(yīng)為y軸，繪制劑量-效應(yīng)回歸分析圖，如呈線性效應(yīng)，采用線性回歸分析；如呈非線性效應(yīng)，則采用非線性回歸分析，選擇合適的模型擬合回歸方程計算給定干擾物濃度的干擾程度。

2 結(jié)果

2.1樣本的重復(fù)次數(shù) HBV DNA在103IU/mL濃度水平，s為0.09 IU/mL，dmax/s為4.62；在106IU/mL濃度水平，s為0.05 IU/mL，dmax/s為7.85，查附表，2個濃度水平的樣本重測次數(shù)(n)均為3。

2.2配對差異試驗 結(jié)果見表1。34.0 mmol/L的三酰甘油和2 g/dL的血紅蛋白對HBV DNA檢測無干擾，差值<0.4(LOG值)，符合廠家聲明。476.0 μmol/L的總膽紅素對103IU/mL 濃度水平的HBV DNA檢測無干擾；在106IU/mL水平處測試樣本和對照樣本差值為0.44(LOG值)，按四舍五入原則，符合廠家聲明。40 g/L的總IgG對103IU/mL濃度水平的HBV DNA檢測有負(fù)干擾，需進(jìn)一步利用劑量效應(yīng)試驗測定干擾效應(yīng)。

表1 干擾物對HBV DNA檢測的配對差異實驗結(jié)果(LOG值)

注：*，表示有干擾。

2.3劑量效應(yīng)試驗 總IgG干擾效應(yīng)測試樣本的5個系列濃度分別為12.0 g/L、21.0 g/L、30.0 g/L、39.0 g/L和48.0 g/L。總IgG≤48.0 g/L時，對HBV DNA檢測為非線性負(fù)干擾，劑量-效應(yīng)曲線見圖1、圖2。非線性方程分別為y=1.693 2-1.509 3In(x) (R2=0.92，P=0.01)，y=0.046 1-0.002 2x-0.000 3x2(R2=0.98，P=0.02)。

圖1 總IgG對103 IU/mL濃度HBV DNA檢測的干擾效應(yīng)

圖2 總IgG對106 IU/mL濃度HBV DNA檢測的干擾效應(yīng)

3 討論

EP7-A2文件是目前分析干擾評價試驗的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)[3]，EP7-A2采用配對差異、劑量效應(yīng)和利用患者標(biāo)本作偏倚分析，但都存在局限性。前2種添加外源性干擾物，實驗樣本基質(zhì)不代表典型有問題的臨床樣本；第3種方案參照EP9-A2，選擇真實的特定患者標(biāo)本(如高血脂等)以減少基質(zhì)效應(yīng)，但只能證明偏倚和估計的干擾物某水平的相關(guān)性，不能證明因果關(guān)系。本研究參照EP7-A2采用配對差異和劑量效應(yīng)實驗進(jìn)行干擾評價，但樣本選擇患者標(biāo)本，將EP7-A2的3種方案結(jié)合應(yīng)用于干擾評價，既達(dá)到統(tǒng)計學(xué)要求的檢驗水準(zhǔn)，又可減少基質(zhì)效應(yīng)。

我國2015年《中國慢性乙型肝炎防治指南》[4]推薦接受抗病毒治療的人群為HBeAg陽性患者HBV DNA≥20 000 IU/mL；HBeAg陰性患者HBV DNA≥2 000 IU/mL。本研究選擇103和106IU/mL的2個病理濃度水平作為HBV DNA檢測干擾評價實驗的高、低分析物濃度，結(jié)果表明三酰甘油、血紅蛋白和總膽紅素對HBV DNA檢測的干擾評價均符合廠家干擾聲明。方芳等[5]研究表明總膽紅素在274.6 μmol/L時即對HBV DNA檢測存在干擾，崔蕾蕾等[6]表明總膽紅素高于400 μmol/L對結(jié)果存在影響，但是2項研究均添加商品化外源性膽紅素作為測試樣本，不能代表真實的患者病理標(biāo)本，而本研究分析患者的真實標(biāo)本，能直接評價病理血清標(biāo)本中存在的干擾物及其干擾效應(yīng)。

人血清中存在的IgG是PCR抑制劑，但目前國內(nèi)對HBV DNA檢測的IgG干擾驗證報道較少。本研究表明40 g/L的總IgG對HBV DNA檢測存在負(fù)干擾，進(jìn)一步用劑量效應(yīng)實驗測定其干擾效應(yīng)為非線性負(fù)干擾。擬合非線性回歸模型時既要考慮決定系數(shù)(R2)，又要有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但同時也應(yīng)注意如果為了單純得到較大R2，模型形式可能會很復(fù)雜，使其中參數(shù)無法解釋實際意義，也不可取，應(yīng)結(jié)合實際解釋和應(yīng)用效果來確定最終曲線。本研究在低濃度水平選擇對數(shù)曲線，高濃度水平選擇拋物線擬合非線性方程，可通過回歸方程估計不同濃度總IgG對HBV DNA檢測的干擾程度，如40 g/L的總IgG對103IU/mL濃度HBV DNA檢測的干擾效應(yīng)為-0.72 LOG，在106IU/mL濃度處的干擾效應(yīng)為-0.52 LOG。劑量效應(yīng)試驗在計算干擾效應(yīng)時，低濃度水平(12 g/L)處為各測定結(jié)果減去低濃度標(biāo)本的均值，即低濃度干擾效應(yīng)標(biāo)示值在0左右。配對差異試驗為40 g/L的干擾樣本直接與12 g/L的對照樣本進(jìn)行偏倚評估，故差值(-0.62 LOG)與劑量效應(yīng)試驗的干擾程度(-0.72 LOG)有差異，在評價干擾效應(yīng)時通常采用劑量-效應(yīng)回歸分析。通過干擾評價，實驗室可認(rèn)為HBV DNA呈-0.72 LOG的改變是有意義的干擾，即該變化是由40 g/L的總IgG干擾所致，而不是臨床治療的效果。本研究所采用的干擾評價新方法學(xué)和總IgG對HBV DNA測定結(jié)果的干擾現(xiàn)象仍需臨床試驗進(jìn)一步驗證。