朱心雨，明心亮，馮艷林，賀丁冬，涂建成(武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗科基因診斷中心，武漢 430071)

血漿脂蛋白是在體內(nèi)輸送或攝取特定脂質(zhì)的異質(zhì)性血液顆粒，因此其在脂質(zhì)代謝、信號傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。這些顆粒由疏水性三酰甘油和膽固醇酯的核心組成，被磷脂、膽固醇和載脂蛋白等組成的親水性外殼所包圍，根據(jù)其密度、大小和蛋白質(zhì)組成不同，脂蛋白可分為5個主要類別：乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)，即主要是含apoB的脂蛋白;以及高密度脂蛋白(HDL)，即主要是含apoA1的脂蛋白(見表1)。血漿脂蛋白因其大小、組成和代謝特性方面有所不同又可以進(jìn)一步分為幾個亞組分，在心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)尤其是動脈粥樣硬化發(fā)病中發(fā)揮重要作用。目前血漿脂蛋白常根據(jù)超速離心法(ultracentrifugation,UC)對其進(jìn)行分離；此外，脂蛋白也可以根據(jù)其電泳遷移率或其載脂蛋白的含量進(jìn)行分離，以進(jìn)一步分離脂蛋白并建立相應(yīng)的脂蛋白譜。盡管目前對于脂蛋白顆?；騺喗M分在CVD風(fēng)險評估中尚無共識，但已有研究表明，LDL和HDL大小或顆粒濃度是未來預(yù)測CVD風(fēng)險的重要檢測指標(biāo)。以下將對幾種新型的檢測方法進(jìn)行介紹。

表1 脂蛋白組分分類

1 電噴霧差分電遷移率分析

電噴霧差分電遷移率分析(electrospray differential mobility analysis, ES-DMA)也被稱為離子遷移率分析法(ion mobility, IM)，Kaufman等[1]于1998年首次報道該方法用于納米顆粒和大離子尺寸的測量；Caulfield等[2]在2008年報道了該方法首次應(yīng)用于脂蛋白分析。ES-DMA是一個可以選擇和計算氣溶膠相中完整脂蛋白顆粒的系統(tǒng)，其工作原理為用電噴霧接口將血清中的脂蛋白霧化，隨后電噴霧接口中的中和源向生成的氣溶膠施加已知的電荷分布，在下游使用由漂移管組成的差分電遷移率分析儀來選擇霧化的脂蛋白，根據(jù)大氣壓下的電遷移率逐漸選擇在大氣壓力下經(jīng)受電場傾斜的脂蛋白，然后在凝結(jié)核粒子計數(shù)器中通過激光檢測并對選定的脂蛋白進(jìn)行計數(shù)。ES-DMA已被證明其在脂蛋白檢測中具有一定價值，但在臨床實驗室中幾乎沒有開展該項目。對于ES-DMA來說自動化和大樣本檢測是可以實現(xiàn)的；此外，ES-DMA對干擾尤其是血清蛋白產(chǎn)生的干擾相對較敏感，因此通常需要特定的樣品制備步驟來獲得精確的脂蛋白譜。盡管如此，ES-DMA的一個優(yōu)點是它可以在短時間內(nèi)檢測出樣品的完整脂蛋白譜，與報道的大多數(shù)脂蛋白譜分析和定量方法不同，ES-DMA是唯一一種被測物是完整脂蛋白的方法[3]。

2 垂直自動分離法

垂直自動分離法(vertical auto profile,VAP)由Chung等[4]在80年代首次報道。該方法是一種半自動化的系統(tǒng)，其原理主要是通過順序超速離心進(jìn)行脂蛋白分離。

VAP-Ⅱ?檢測脂蛋白譜有兩個過程。首先，通過單垂直旋轉(zhuǎn)密度梯度UC分離脂蛋白，不連續(xù)的梯度可確保根據(jù)脂蛋白各自的浮懸率充分分離脂蛋白，使密度最高的最終位于管的底部；自動連續(xù)酶促測定法通過膽固醇含量對這些分離的脂蛋白進(jìn)行定量；然后在505 nm處測量吸光度以確定每個脂蛋白類別和亞類相關(guān)的膽固醇濃度，從而提供脂蛋白譜。此外，可通過軟件中包含的算法將膽固醇濃度進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為apoB的等效濃度。梁純子等[5]研究得出VAP血脂分型檢測在傳統(tǒng)實驗室血脂項目的基礎(chǔ)上增加了特殊內(nèi)容，使患者脂質(zhì)數(shù)據(jù)更有臨床操作性、耗時更少、信息更豐富，避免了多重檢測帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和時間壓力。該系統(tǒng)經(jīng)歷了各種優(yōu)化，并由Atherotech在2016年對其進(jìn)行了優(yōu)化[3]，VAP-Ⅱ-fingerstick?(VAP-Ⅱ-fs)可通過少量的血漿(18 μL)檢測出患者的脂蛋白譜，而VAP-Ⅱ是具有更好分辨率和性能的系統(tǒng)，但用該方法檢測需要更多的患者血漿。VAP在我國的臨床應(yīng)用需要多地區(qū)、多中心的研究數(shù)據(jù)支撐。

3 核磁共振波譜法

核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance, NMR)是一種能夠分析脂蛋白顆粒的新型檢測技術(shù)，其原理主要取決于不同脂蛋白顆粒中脂質(zhì)的甲基部分以不同的頻率共振，因此脂蛋白可以通過將核心脂質(zhì)的甲基信號分解為單個信號，或在整個甲基包膜上使用統(tǒng)計方法估算脂質(zhì)濃度來定量。當(dāng)前已有3種方法使用NMR對脂蛋白顆粒進(jìn)行檢測。Otvos[6-7]所描述的方法提供了主要脂蛋白類型(VLDL、LDL和HDL)的大小和顆粒數(shù)以及9種脂蛋白亞類的顆粒數(shù)，此方法基于某種算法將其NMR甲基信號與血清或血漿樣品中脂蛋白的NMR信號進(jìn)行擬合，通過透射電子顯微鏡和梯度凝膠電泳確定分離的脂蛋白部分的粒度。 Kaess等[8]描述的第2種方法通過磁場梯度強(qiáng)度和溫度來測量樣品的12種脂蛋白亞類。Ala-Korpela等[9-11]描述的第3種方法估計主要脂蛋白類別的脂質(zhì)含量、大小和顆粒數(shù)量，以及14種脂蛋白亞類的顆粒數(shù)量并且通過高效液相色譜獲得的顆粒粒徑。目前對將基于NMR的高級脂蛋白檢測方法引入臨床實踐仍存在一些爭議，作為NMR方法的替代方法，研究人員開發(fā)出了一種基于二維擴(kuò)散有序1H NMR光譜(2D diffusion-ordered 1H NMR spectroscopy, DOSY)用來檢測脂蛋白顆粒的新方法，也被稱作Liposcale測試[12-13]。NMR需要訓(xùn)練有素的技術(shù)人員和精密的儀器，脂蛋白的定量準(zhǔn)確性很大程度上取決于用于信號解卷積的處理軟件，該軟件使用實驗庫來處理高度復(fù)雜的光譜，目前沒有找到有關(guān)建立處理算法的方式或系統(tǒng)校準(zhǔn)的數(shù)據(jù)，結(jié)果的溯源性仍然不清楚；但脂蛋白譜檢測自動化、更少的分離步驟、檢測時間縮短和患者負(fù)擔(dān)得起的測定方法使其逐漸在臨床試驗中廣泛得到使用。

4 凝膠滲透高效液相色譜法

凝膠滲透高效液相色譜法(gel permeation-high-performance liquid chromatography,GP-HPLC)由Hara等[14]于1980年首次報道，近來，該方法被用于常規(guī)和高通量脂蛋白譜測量，涉及自動數(shù)據(jù)處理的GP-HPLC系統(tǒng)被稱為LipoSEARCH?，該系統(tǒng)已被全球許多研究人員所使用，發(fā)表文章近300多篇[15-16]。GP-HPLC根據(jù)尺寸排阻色譜(size exclusion chromatography, SEC)的原理按照其水合粒徑的不同而分離脂蛋白。Oda等[17]和Yanai等[18]建立了一種新方法，即陰離子交換高效液相色譜法(anion-exchange high-performance liquid chromatography,AEX-HPLC)，并評估了AEX-HPLC在冠心病、糖尿病和腎病患者以及健康志愿者中的臨床有效性，結(jié)果表明通過AEX-HPLC測定的IDL和VLDL中的膽固醇水平可能是冠心病或糖尿病的危險生物標(biāo)志物。AEX-HPLC可以代替超速離心法分離人血清中HDL、LDL、IDL、VLDL等5種脂蛋白餾分。該方法還于2014年在日本的公共醫(yī)療保險中被批準(zhǔn)用于臨床。HPLC作為脂蛋白分析的工具，其優(yōu)點如下：(1)可以從色譜柱中回收樣品中的相應(yīng)成分，并對其進(jìn)行重復(fù)分析；(2)分離過程中樣品的降解或變性比超速離心等其他分離技術(shù)更低；(3)色譜圖的分析簡單、容易，因為其分離的基礎(chǔ)僅基于粒徑。

5 同位素稀釋質(zhì)譜法

同位素稀釋質(zhì)譜法(isotope-dilution mass spectrometry, ID/MS)是臨床生物化學(xué)檢驗中許多生物標(biāo)志物尤其是TG和TC測量的高級參考方法。通過液相色譜ID/MS(liquid chromatography ID/MS, LC-ID/MS)對載脂蛋白進(jìn)行定量分析由Barr等[19]在1990年代末首次報道，并在接下來的幾年中進(jìn)一步應(yīng)用于檢測其他載脂蛋白(apoA-Ⅰ、apoB、apoC和apoE)。通過LC-ID/MS對載脂蛋白進(jìn)行絕對定量分析時，需要依靠胰蛋白酶消化血清載脂蛋白,消化后針對每種主要的載脂蛋白鑒定載脂蛋白特異的胰蛋白酶肽，并選擇其中一些肽進(jìn)行ID/MS定量，ID/MS定量使用帶有13C、15N或2H作為內(nèi)標(biāo)(internal standards, IS)的合成標(biāo)記實體來加標(biāo)樣品。鑒于該種方法的高精度、良好可比性、可溯源性以及高通量等特點，LC-ID/MS已成為用于血清中apoB和apoA等脂蛋白定量候選參考方法之一。 但是由于這種方法需要使用昂貴的試劑以及專業(yè)的的技術(shù)人員和精密儀器，因此目前主要用于科研中，尚未應(yīng)用到臨床實驗室進(jìn)行常規(guī)檢查[20]。

6 高級脂蛋白檢測方法可比性

對于高級脂蛋白檢測方法可比性的討論，主要集中于方法之間缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，以及每種方法所涉及的測量原理不同。一些方法根據(jù)其密度分離脂蛋白，一些根據(jù)其大小分離脂蛋白，有些根據(jù)其脂質(zhì)或蛋白質(zhì)含量分離脂蛋白；類似地，一些方法通過其載脂蛋白成分檢測脂蛋白，而另一些方法檢測完整的脂蛋白；盡管高級脂蛋白檢測方法都旨在測量脂蛋白及其亞類的構(gòu)成情況，但分離技術(shù)和操作條件不同，用這些方法獲得結(jié)果的可比性和等效性不足；迄今為止，尚無直接比較所有高級脂蛋白檢測方法檢測結(jié)果的報道，大多數(shù)僅通過一對一比較，少有研究直接比較幾種高級脂蛋白檢測方法。2006年Ensign等[21]使用VAP、NMR、梯度凝膠電泳(gradient gel electrophoresis, GGE)和管式凝膠電泳(tube gel electrophoresis , TGE)基于LDL大小測量結(jié)果對不同的患者表型分類，結(jié)果表明，在39個患者樣本中，只有3個被歸類為具有相同的LDL表型，即幾種方法一致性不到8%。2011年Grundy等[22]在SAFARI(辛伐他汀聯(lián)合非諾貝特治療高脂血癥)隊列研究中通過VAP、NMR和免疫比濁法測量apoB濃度與非HDL-C并進(jìn)行比較，最終結(jié)果顯示每種方法得出的apoB濃度一致性較差。

在過去的幾十年中，研究工作集中在確定新的生物標(biāo)志物以更好地預(yù)測患者發(fā)生CVD的風(fēng)險上[23]。據(jù)報道，大量臨床和前瞻性研究旨在證明這些疾病與某一種特定生物標(biāo)志物的相關(guān)性，但是這些研究結(jié)果往往受到質(zhì)疑，特別是關(guān)于apoB和LDL顆粒濃度測量之間的相關(guān)性[24]。許多專業(yè)組織發(fā)布了有關(guān)CVD風(fēng)險管理的指南[25-26]，其中關(guān)于高級脂蛋白檢測方法尤其是apoB濃度測量的爭論仍然存在。實際上，最新指南并不一定建議對患者進(jìn)行風(fēng)險管理時應(yīng)使用高級脂蛋白檢測方法，并且大多數(shù)與高級脂蛋白檢測方法相關(guān)的綜述都表示沒有足夠的證據(jù)來促進(jìn)高級脂蛋白檢測方法在常規(guī)中的使用。因此，除非當(dāng)出現(xiàn)特殊的血脂異常時，大多數(shù)監(jiān)管機(jī)構(gòu)都不建議使用高級脂蛋白檢測方法。

7 總結(jié)

臨床實驗室對疾病診斷的作用正在不斷發(fā)展，以向臨床醫(yī)生提供更多信息，評估CVD風(fēng)險并更有效地進(jìn)行靶向治療。在常規(guī)檢測中，廣泛采用DGUC、免疫比濁法(immunonephelometry, IN)或ELISA等進(jìn)行脂蛋白定量。全自動性、較低的成本、可接受的精度以及高通量分析等優(yōu)點使它們成為常規(guī)脂蛋白檢測的方法；然而，對脂蛋白譜的高度關(guān)注導(dǎo)致了許多其他高級脂蛋白檢測方法的發(fā)展，這些新方法依賴于各種分離原理，這些原理利用脂蛋白的不同特征來建立脂蛋白譜，例如它們的脂質(zhì)含量、載脂蛋白含量或大小。盡管目前已有許多方法都用于檢測脂蛋白譜(見表2)，但由于各種方法在檢測脂蛋白亞組分中缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)相關(guān)性和結(jié)果可比性，在一定程度上可能會導(dǎo)致不同的臨床診斷和醫(yī)療決策，對研究脂蛋白亞組分與CVD等相關(guān)疾病之間的關(guān)系產(chǎn)生影響。為了解決這一問題，我們應(yīng)在脂蛋白分離檢測方法以及檢測指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化等方面做出更多努力，為評估脂蛋白亞組分在CVD等疾病發(fā)病風(fēng)險和預(yù)后中提供幫助。

表2 高級脂蛋白檢測檢測方法的優(yōu)缺點比較