劉雅涵 謝天皓 孟慶旭 靳小石2

(1.河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省普通外科數(shù)字醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北 保定 071000；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000)

根據(jù)2019年1月份國家癌癥中心發(fā)布的最新全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，目前惡性腫瘤發(fā)病率最高的為肺癌，其次為乳腺癌，而女性發(fā)病率最高的為乳腺癌，死亡率在女性占到第5位[1]。在這樣的背景下，乳腺癌的關(guān)注和研究顯得極為重要?；虻母淖冊谌橄侔┲杏兄匾淖饔谩LC5A8基因自2002年被Rodriguez等[2]發(fā)現(xiàn)以來，有越來越多的學(xué)者研究該基因在惡性腫瘤中的作用。發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)沉默這一現(xiàn)象在腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、肺癌、宮頸癌中普遍存在[3-6]。隨著對SLC5A8基因研究的深入，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、肺癌、胃癌、食管癌等惡性腫瘤的發(fā)生中存在著基因的表觀遺傳學(xué)改變現(xiàn)象，比如抑癌基因的甲基化，從而抑制了抑癌基因的表達(dá)。SLC5A8基因作為目前的候選抑癌基因，是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族第5家族第8成員。目前鮮有對于抑癌基因SLC5A8在乳腺癌中的作用機(jī)制及與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系方面的研究。本研究通過對乳腺癌及其癌旁組織中SLC5A8基因甲基化及SLC5A8轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的實驗性研究，以明確SLC5A8基因在乳腺癌中的表達(dá)情況，進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，為后一步的基因治療和預(yù)后評估奠定實驗理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年5月至2019年12月收集河北大學(xué)附屬醫(yī)院基本外科行乳腺癌改良根治術(shù)的32例乳腺癌患者標(biāo)本，將腫瘤標(biāo)本及癌旁正常組織標(biāo)本分為實驗組和對照組?；颊咝g(shù)前未行任何治療，術(shù)后病理回示為惡性，所有患者均為女性，年齡42～56歲，平均為(49.00±5.23)歲。

Omega E.Z.N.A.TM總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒、組織DNA提取試劑盒、瓊脂糖、氯仿、無水乙醇、5×RNA loading buffer、微量高速冷凍離心機(jī)、全波長酶標(biāo)儀、全自動凝膠成像儀、實時熒光定量PCR儀、實驗所用引物由上海英濰捷貿(mào)易有限公司提供，引物序列見表1。

表1 基因引物序列及擴(kuò)增片段

1.2 實驗方法

1.2.1 SLC5A8基因甲基化檢測

采用甲基化特異性PCR法檢測，按照DNA提取試劑盒說明書步驟提取樣本組織DNA并修飾，將對應(yīng)引物進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾DNA樣本的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃中預(yù)變性2 min；95 ℃中15 s；60 ℃中30 s，如此40次循環(huán)。最后對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳照相。

1.2.2 SLC5A8基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測

運(yùn)用RT-PCR法檢測SLC5A8基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。實驗按照RNA提取試劑盒說明提取總RNA，對RNA總量進(jìn)行定量配平后對其行反轉(zhuǎn)錄。檢測引物序列特異性后，分別用以上2對引物行RT-PCR。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s，如此40次循環(huán)后，對反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳照相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌和乳腺癌旁正常組織SLC5A8基因甲基化檢測

在乳腺癌組織中SLC5A8基因發(fā)生甲基化20例(62.50%)，而在乳腺癌旁正常組織的基因發(fā)生甲基化7例(21.87%)。癌旁正常組織的基因發(fā)生甲基化的概率相較癌組織的基因甲基化的概率降低，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌及癌旁組織SLC5A8基因甲基化檢測

2.2 乳腺癌及癌旁組織SLC5A8基因擴(kuò)增后凝膠電泳結(jié)果

乳腺癌及乳腺癌旁組織的SLC5A8基因RT-PCR結(jié)果的凝膠電泳如圖1，32例乳腺癌組織中SLC5A8基因明顯過表達(dá)占43.75%(14/32)，而乳腺癌旁正常組織該基因71.25% (26/32)出現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象，提示癌組織中SLC5A8基因的過表達(dá)水平明顯低于乳腺癌癌旁正常組織水平，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

圖1 SLC5A8基因擴(kuò)增后凝膠電泳

表3 乳腺癌及癌旁組織SLC5A8基因過表達(dá)檢測

2.3 乳腺癌組織SLC5A8基因甲基化與轉(zhuǎn)錄表達(dá)

在32例乳腺癌組織中，SLC5A8基因甲基化陽性的有20例標(biāo)本，基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)者6例(30.00%)；基因未轉(zhuǎn)錄表達(dá)者14例(70.00%)。癌組織中基因甲基化陰性有12例標(biāo)本，基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)者7例(58.33%)；基因未轉(zhuǎn)錄表達(dá)者5例(41.66%)。無序變量相關(guān)性分析顯示,乳腺癌組織中SLC5A8基因甲基化和SLC5A8基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)兩者一致性較差,反而具有一定的反向一致性，這也驗證了乳腺癌組織SLC5A8基因甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)不是完全一致的，癌組織基因甲基化陽性標(biāo)本的基因轉(zhuǎn)錄水平相對較低，并且要弱于基因甲基化陰性標(biāo)本的基因轉(zhuǎn)錄水平，故2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 乳腺癌SLC5A8基因甲基化與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)關(guān)系

3 討論

自2002年Rodriguez等[2]發(fā)現(xiàn)SLC5A8基因以來，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)沉默這一現(xiàn)象在腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中普遍存在[3-6]。進(jìn)一步揭示了SLC5A8基因表達(dá)下降的機(jī)制主要與該基因外顯子1中CPG島廣泛甲基化有關(guān)[7]。進(jìn)一步研究得出,SLC5A8基因與染色體組蛋白脫乙?；钢饕ㄟ^丁酸相關(guān)聯(lián)[8]。在結(jié)腸腸腔中的細(xì)菌經(jīng)過一定作用將膳食纖維分解成丁酸，使其濃度升高。結(jié)腸上皮細(xì)胞的SLC5A8基因表達(dá)增高，SLC5A8基因可以將丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，同時他作為組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，在上皮細(xì)胞的癌前病變方面可以預(yù)防的同時還對腫瘤細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用[9-12]。SLC5A8基因在其他臟器中預(yù)防細(xì)胞發(fā)生癌變則主要是通過與抗凋亡蛋白相互作用實現(xiàn)的[13]。二氯乙酸也是該基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用底物中的一個，聯(lián)合應(yīng)用5雜氮胞苷，同樣具有明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[14]。SLC5A8基因廣泛表達(dá)于人體的各個組織器官，屬于候選抑癌基因，對細(xì)胞有保護(hù)作用。腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中選擇性地使SLC5A8基因表達(dá)下降，維持自身增殖狀態(tài)，是最終避開凋亡的重要機(jī)制。如果SLC5A8基因的表觀遺傳學(xué)變化是乳腺癌組織發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，這將在未來對乳腺癌的分子生物學(xué)治療具有重要意義。對乳腺癌中SLC5A8基因的甲基化及轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)SLC5A8基因甲基化和基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平降低與乳腺癌關(guān)聯(lián)性，研究發(fā)現(xiàn)實驗組的甲基化陽性率顯著高于對照組甲基化陽性率(P<0.05)。實驗組中甲基化陽性的癌組織基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)率較甲基化陰性的癌組織基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)率顯著降低(P<0.05)，癌組織SLC5A8基因甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)不是完全一致的，癌組織基因甲基化陽性標(biāo)本的基因轉(zhuǎn)錄水平相對較低，并且要弱于基因甲基化陰性標(biāo)本的基因轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步表明在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能不止存在表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，還存在其他事件。上述結(jié)果和概括得出SLC5A8基因的甲基化是乳腺癌中普遍存在的一種現(xiàn)象，并可能是乳腺癌演變過程的重要一步，并且是SLC5A8基因轉(zhuǎn)錄水平降低的主要因素。這為進(jìn)一步研究SLC5A8基因的表觀遺傳學(xué)變化在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)，并且對乳腺癌的分子生物學(xué)治療提供可靠證據(jù)。