王維娜，趙春蘭2，梁月勉，王曄興，張文清

(1.河北大學附屬醫(yī)院病理科，河北 保定 071000；2.保定市婦幼醫(yī)院病理科，河北 保定 071000)

Nupr1是最初在急性胰腺炎中發(fā)現(xiàn)的一個小分子應激核蛋白[1]，后來發(fā)現(xiàn)它與多種腫瘤發(fā)生及進展有關。關于它在乳腺癌中的作用研究很少，本研究檢測了乳腺癌組織(實驗組)及乳腺良性病變組織(對照組)Nupr1 mRNA及蛋白表達情況，并分析了其與乳腺癌臨床病理特征的關系，探討Nupr1表達與乳腺癌發(fā)生、進展、預后的關系，以期為臨床個體化治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

隨機選取2012年1月至2018年12月河北大學附屬醫(yī)院乳腺科術前未接受治療的手術切除228例乳腺癌(包括非特殊型浸潤性癌161例，特殊型浸潤性癌67例)及60例良性乳腺病變(對照組)，常規(guī)石蠟包埋備免疫組化檢測。留取上述病例中部分行術中冰凍送檢的新鮮組織(包括乳腺癌30例，良性乳腺病變41例，不典型導管增生19例)，組織離體后盡快置于-80 ℃液氮冷凍并低溫冰箱保存?zhèn)鋗RNA檢測用。患者均為女性，年齡22～70歲，中位年齡52歲。由2名資深病理醫(yī)師復閱切片確診。本研究經河北大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測

免疫組化S-P檢測試劑盒購自北京中杉生物技術公司，染色步驟按說明書進行。Nupr1兔抗人多克隆抗體購自上?？泼羯锟萍加邢薰?。其余抗體(ER、PR、HER-2、Ki67)購自福州邁新公司，0.01%PBS代替一抗作陰性對照。HER-2的判定參照《乳腺癌HER2檢測指南》[2]。Nupr1判定標準：高倍鏡下計數100個細胞中著色細胞百分比，取5個視野的平均值。評分標準：陰性為0分、陽性細胞≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。染色強度：無染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、深棕色為3分。兩得分相乘，以總分4分為分界點，將<4分者定義為Nupr1陰性，≥4分者為Nupr1陽性[3]。其余免疫組化參照2012版WHO乳腺癌組織學與分子遺傳學分類標準。分子分型參照2018年乳腺癌診療指南。由2位病理醫(yī)師盲法觀察，記數10個高倍視野染色豐富區(qū)200個癌細胞中著色細胞數，計算著色細胞比例，取平均值。

1.2.2 實時定量PCR檢測

總RNA提取用Trizol、RT-PCR試劑盒均購自武漢博士德公司。RT-PCR引物由上海生物工程有限公司合成。mRNA檢測標本取自術后新鮮組織，根據試劑盒說明書提取總RNA。取2 μg總RNA，加入oligoDT、逆轉錄酶，25 ℃ 5 min→42 ℃ 10 min→50 ℃ 60 min→70 ℃ 5 min進行逆轉錄反應。Nupr1(211 bp)引物序列：5′-GCG GGC ACG AGA GGA AAC-3′; 5′-CTC AGT CAG CGG GAA TAA GTC-3′; GAPDH作為內參標，引物(121 bp)序列：5′-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT -3′; 5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT -3′。取逆轉錄產物 2 μL，加入引物各0.5 μL、SYBR GREEN MAsterMix10 μL置 iQTM SYBR Green Supermix上 (Bio-Rad, Her-cules, CA) 。PCR循環(huán)參數95 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，共循環(huán)40個周期,72 ℃ 4 min 延伸。樣本均設3個平行對照以保證實驗結果的準確性。采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 實驗結果

2.1 Nupr1 mRNA的表達

實時熒光定量PCR溶解曲線分析證實擴增產物具有特異性。乳腺癌、不典型導管增生、良性乳腺病變3組間mRNA相對表達量分別為3.25±0.46、2.23±0.50、0.08±0.31，差異有統(tǒng)計學意義(F=18.324，P<0.05)，其中乳腺癌及不典型導管增生組中 Nupr1 mRNA表達均高于良性乳腺病變組(t=2.613，P<0.05；t=6.339，P<0.05)。

2.2 Nupr1蛋白在不同組中的表達

Nupr1蛋白在乳腺癌中顯示胞漿、胞核著棕黃色顆粒(圖1)，免疫組化結果顯示乳腺癌組Nupr1蛋白高表達率53.5%，部分乳腺癌顯示陰性表達(圖2)，乳腺良性病變組Nupr1蛋白高表達率16.7%。乳腺癌組中Nupr1蛋白表達高于乳腺良性病變組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.969，P<0.0001)。

2.3 Nupr1蛋白在不同組織學類型乳腺癌中的表達

非特殊型浸潤性癌Nupr1蛋白高表達率53.4%,特殊型浸潤性癌(包括浸潤性小葉癌、浸潤性微乳頭狀癌、腺樣囊性癌)Nupr1蛋白高表達率53.7%,非特殊型浸潤性癌與特殊型浸潤性癌Nupr1蛋白高表達率差異無統(tǒng)計學意義，Nupr1的表達與組織學類型無關(χ2=0.002，P=0.964)。

圖1 乳腺癌組織中Nupr1呈核/漿強陽性著色(免疫組化S-P法，40×10)

圖2 部分乳腺癌組織中Nupr1陰性(免疫組化S-P法，40×10)

2.4 Nupr1蛋白表達與乳腺癌分期的關系

Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期乳腺癌Nupr1蛋白高表達率分別為28.6%、52.8%、85.15%。Nupr1蛋白高表達與乳腺癌分期有關(χ2=33.970,P<0.0001)，隨著腫瘤分期的進展，Nupr1蛋白表達有逐漸增高的趨勢，其中Ⅲ期乳腺癌Nupr1蛋白高表達率高于Ⅰ期(χ2=32.900，P<0.0001)及Ⅱ期(χ2=15.790，P<0.0001)，差異有統(tǒng)計學意義；Ⅱ期乳腺癌Nupr1蛋白高表達率高于Ⅰ期(χ2=9.160，P=0.002)。

2.5 Nupr1蛋白表達與不同分子分型的關系

Luminal A型、Luminal B型、三陰性型及HER-2型乳腺癌Nupr1蛋白高表達率分別為47.7%、44.4%、51.4%、75.6%。不同的分子分型Nupr1蛋白高表達率不同(χ2=14.367，P<0.001)。其中三陰性型、Luminal A、B型Nupr1蛋白高表達率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.360，P=0.834)，HER-2型Nupr1蛋白表達率高于Luminal A型、Luminal B型、三陰性型，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=10.703，P=0.001；χ2=6.801，P=0.009；χ2=8.851，P=0.003)。

2.6 Nupr1蛋白表達與乳腺癌腫瘤大小、組織學分級、月經狀態(tài)的關系

Nupr1蛋白表達與乳腺癌患者月經狀態(tài)無關。腫瘤大小以2.0 cm為界， Nupr1蛋白表達與乳腺癌腫瘤大小無關。參照Nottingham聯(lián)合組織學分級標準對乳腺癌進行組織學分級， Nupr1蛋白表達與乳腺癌組織學分級無關(表1)。

表1 Nupr1蛋白表達與乳腺癌腫瘤大小、組織學分級、月經狀態(tài)的關系

3 討論

Nupr1作為一廣泛分布于體內的應激誘導蛋白，首次在大鼠急性胰腺炎腺泡細胞中被發(fā)現(xiàn)。人類Nupr1基因編碼相對分子量約8×103的小分子核蛋白，故被命名為P8。Nupr1具有轉錄活性，通過參與不同的胞內信號途徑發(fā)揮不同的功能。非腫瘤性病變中，可發(fā)揮抗炎、自噬等作用。且已證實它在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程起重要作用[4-8]。包括在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的促進作用，其機制可能與蛋白激酶A路徑保護細胞免受代謝應激誘導的自噬性死亡、抑制細胞凋亡有關。下調胰腺癌細胞中Nupr1的表達會導致細胞線粒體功能異常,引起程序介導的細胞壞死；另外在口腔鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝細胞癌、甲狀腺乳頭狀癌中均顯示高表達，且與患者年齡、腫瘤進展、腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度有關[9-11]。Zeng等[12]發(fā)現(xiàn)抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞Nupr1的表達可通過改變Caspase蛋白及PTEN的狀態(tài)誘導細胞凋亡。以上研究均支持Nupr1在腫瘤發(fā)生進展中起促進作用。另一種觀點認為Nupr1在某些腫瘤中也可能作為腫瘤生長抑制因子發(fā)揮作用，這似乎與先前的文獻報道矛盾，但可能Nupr1的獨特之處就在于其具備復雜的生物學功能,包括前列腺癌、膀胱癌細胞中Nupr1表達均低于正常組織，且它的表達水平與腫瘤的浸潤及增殖能力呈負相關[13-14]。有研究者認為Nupr1作為一種內在無序蛋白，與細胞內一些復合物結合后，可以誘導細胞生長停止和衰老, 減少細胞遷移, 減少化學耐藥,并成功地阻止了裸鼠體內腫瘤的進展，提示它可能作為腫瘤治療的潛在靶點[15]。Jia等[16]也發(fā)現(xiàn)惡性黑色素瘤細胞中，下調Nupr1的表達，可通過P53基因的途徑促進腫瘤細胞的增生，同樣推測Nupr1為潛在的腫瘤抑制基因。

在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Nupr1的表達情況不盡一致。Ree等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Nupr1可以在人類乳腺癌發(fā)展的早期發(fā)揮促進腫瘤生長的作用，且與乳腺癌轉移及預后不良相關，這提示Nupr1可能是促進腫瘤細胞向遠處轉移生長的關鍵蛋白。Jung等[17]發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌細胞系中染色體16p11.2及17q12循環(huán)區(qū)改變與腫瘤預后不良有關，二者共同陽性的腫瘤預后更差，而Nupr1基因定位于16p11.2，HER-2定位于17q12，推測基因拷貝數的異常改變參與了腫瘤的轉移。本研究發(fā)現(xiàn)，HER-2型乳腺癌Nupr1表達水平明顯高于其他分子類型乳腺癌，可能與此變化有關。Jiang等[18]卻發(fā)現(xiàn)預后差的乳腺癌中Nupr1表達降低，且發(fā)生淋巴結轉移的腫瘤比無淋巴結轉移的Nupr1表達水平低，ER-beta陽性且低水平表達Nupr1的腫瘤生存期短，推測Nupr1在乳腺癌細胞中的作用與在膀胱癌、前列腺癌中的作用類似，可能起腫瘤抑制基因的作用并參與雌激素調節(jié)細胞的生長，其中Nupr1可能受雌激素和泛素通路雙重調節(jié)。而Ito等[11]發(fā)現(xiàn)Nupr1的表達與乳腺癌細胞凋亡指數呈負相關。

基因表達的調控體現(xiàn)在轉錄水平、轉錄后調控、翻譯調控及翻譯后調控，本研究發(fā)現(xiàn)，Nupr1 mRNA在乳腺癌組織顯著高于不典型導管增生及良性乳腺組織，且與蛋白表達一致，提示了此基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。Nupr1蛋白在乳腺導管原位癌及癌前病變中高表達率高于乳腺良性病變，這與某些研究[17]結果一致，推測它在乳腺癌的早期發(fā)生階段發(fā)揮了重要作用，其作用機制可能與它在胰腺癌早期階段有相似之處。同時本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺浸潤性癌中Nupr1的高表達率與腫瘤分期有關，腫瘤的分期越晚，Nupr1高表達率越高。

不同分子分型的乳腺癌中，一般認為Luminal型乳腺癌患者發(fā)病年齡晚、組織學分級低、無病生存期長、預后好，而HER-2型和三陰性型恰好相反[2]。本實驗發(fā)現(xiàn)預后相對不良的HER-2型，Nupr1的表達顯著高于預后較好的Luminal型；而三陰性型Nupr1表達未見顯著升高。這些結果均表明，乳腺癌的晚期進展中，Nupr1有可能起了重要的作用，且Nupr1高表達與乳腺癌的預后不良有關。

上述研究結果表明，Nupr1可能在乳腺癌早期階段即發(fā)生了改變，包括基因學表達的改變，通過信號傳導機制發(fā)揮促腫瘤作用。檢測組織中Nupr1的表達，探討其與細胞內信號機制的關系可以從嶄新的角度明確乳腺癌發(fā)生的機制，檢測Nupr1的表達水平可能作為乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、判斷預后及采用個體化治療方案的有用指標。同時提示Nupr1基因沉默可能是治療乳腺癌的一種很有前途的靶點，需要進一步深入研究。