張仲柏，李艷春，陳潤都，李園鑫，張 梅

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)是指冠狀動脈粥樣斑塊形成使血管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌細胞缺血、缺氧而引起的心臟病。CAD在全球的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，同時氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)被認為是一個明確促進細胞凋亡的病理過程，與多種心血管疾病密切相關(guān)[1，2]。因此，探究CAD的發(fā)病機制，尋找有效的預(yù)防及治療途徑顯得尤為重要。

氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)是從苦參和苦豆子中提取出來的生物堿，具有抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠等多種藥理作用[3-5]，另外OMT在心血管領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用前景，如調(diào)節(jié)血壓、抗心律失常、抗病毒性心肌炎等[6-8]。隨著國內(nèi)外學(xué)者大量研究，OMT對心血管疾病的保護機制也逐漸被揭曉[9-11]，心肌組織核因子相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)/血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)信號通路是人體內(nèi)重要的抗氧化通路[12]，但OMT在心肌細胞OS損傷中的保護機制與該通路的關(guān)系尚未明確，因此，本研究通過建立H9c2心肌細胞OS損傷模型，探討OMT對心肌細胞OS損傷的保護作用與Nrf2 /HO-1信號通路的關(guān)系，進一步了解OMT保護心肌細胞的作用機制并對臨床開發(fā)新藥做出指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞系 H9c2心肌細胞株取自本實驗室，接種于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，并放置于含5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。

1.1.2 主要材料與試劑 高糖DMEM 培養(yǎng)液(美國Gibco公司) ，胎牛血清(美國Gibco公司)，磷酸鹽(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液(北京Solarbio有限公司)，過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)試劑(美國Sigma公司)，BCA蛋白定量試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA) 、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、過氧化氫酶(catalase，CAT)檢測試劑盒 (南京建成生物工程研究所) ，Nrf2、HO-1、β-actin抗體(美國Proteintech Group公司)，HRP 標記山羊抗兔二抗(美國Proteintech Group公司)，TRIzol Reagent細胞裂解液(美國Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)，PCR引物(北京生工生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 取處于對數(shù)生長期的細胞，隨機分為4組：對照組，不給于任何處理；模型組，在細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)4 h；OMT低、高濃度預(yù)處理組，分別用含有10 μmol/L和50 μmol/L的OMT且不含有血清的DMEM完全培養(yǎng)液預(yù)處理12 h，再加入終濃度為100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)4 h。

1.2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察 各組細胞800 r/min離心5 min后棄上清，PBS緩沖液沖洗2～3次后用去離子水進行洗滌，加入蘇木精浸染5 min，用去離子水沖洗后置入伊紅液中2 min，置于通風(fēng)處晾干后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)及細胞個數(shù)，并進行拍照。

1.2.3 Hoechst凋亡染色 將各組細胞以1×104個/孔接種于24孔板內(nèi)，放置于含5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后按照上述實驗方法分別對細胞進行處理并吸盡培養(yǎng)液，根據(jù)Hoechst3325S染色試劑盒說明書，每孔加入固定液后，置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜。去除固定液時避光、搖床上用PBS緩沖液洗滌2～3遍，再加入Hoechst染色液孵育5 min，隨后吸去染色液并用PBS緩沖液洗滌2～3遍，最后滴入封片液封片，同時在340 nm波長的紫外光下激發(fā)，觀察熒光強弱。

1.2.4 細胞活力的檢測 采用MTT法。將各組細胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種細胞數(shù)為1×105個，接種完畢后置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細胞完全貼壁后按照上述實驗方法分別對不同分組的細胞進行處理。隨后加入濃度為5 g/L MTT溶液20μL，培養(yǎng)箱孵育4 h后棄上清，并在每孔中加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μl，振蕩10 min后用酶標儀測定490 nm波長的OD值，各組取平均值后計算細胞存活率：細胞存活率(%)=(實驗組OD值/對照組OD 值)×100%。

1.2.5 細胞培養(yǎng)液中LDH水平的檢測 取各組細胞培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒操作步驟，通過全自動化酶標儀檢測每組細胞上清液中的LDH含量。

1.2.6 心肌細胞中SOD、MDA、GSH、CAT水平的檢測 取各組細胞培養(yǎng)液，在6孔板中每孔加入2 ml PBS洗滌2～3次，采用超聲破碎儀冰水浴中破碎細胞， 3～5 s超聲1次，間隔4次，而后經(jīng)4 ℃離心機1500 r/min離心4 min取上清，最后按照不同試劑盒的操作步驟采用全自動化酶標儀測定各組細胞裂解液中SOD、MDA、GSH、CAT水平。

1.2.7 RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、Casepase3 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達 通過Trizol法提取各組心肌細胞的信使RNA(messenger RNA，mRNA)，運用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成互補脫氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)，最后以cDNA為模板，采用RT-PCR法檢測各組中B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/ leukemias-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)蛋白X(bcl-2 associated x protein，Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Casepase3)、Nrf2、HO-1 mRNA的表達。

1.2.8 Western Blot檢測Nrf2 、HO-1蛋白表達 按照實驗分組處理細胞，用PBS緩沖液洗滌2～3次，收集細胞并加入細胞裂解液4 ℃裂解20 min，離心后收集細胞上清液。用BCA蛋白測定盒測定蛋白總量。取細胞裂解液上清樣于SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride，PVDF)膜上。加入封閉液、一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗工作液室溫進行孵育1 h，洗膜，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測靶蛋白的表達。每組實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 OMT對OS損傷的H9c2心肌細胞形態(tài)的影響 對照組心肌細胞生長狀態(tài)良好，細胞呈長梭形、胞質(zhì)飽滿且結(jié)構(gòu)完整，胞漿透明，細胞排列緊密，貼壁良好(圖1A)。模型組出現(xiàn)大量懸浮細胞，鏡下顯示細胞明顯失去基本結(jié)構(gòu)，皺縮明顯，胞間間隙增大(圖1B)。細胞在低、高濃度OMT預(yù)處理后狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，基本結(jié)構(gòu)較清晰，胞間間隙縮小(圖1C、D)。

圖1 不同濃度的OMT對H9c2心肌細胞形態(tài)的影響(HE, ×100)

A．對照組；B.模型組; C. OMT 10 μmol/L預(yù)處理組; D. OMT 50 μmol/L預(yù)處理組

2.2 OMT對OS損傷的H9c2心肌細胞存活率及LDH漏出量的影響 模型組心肌細胞存活率較對照組降低，LDH漏出量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)OMT低、高濃度預(yù)處理后心肌細胞較模型組存活率升高, LDH漏出量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。

組別存活率(%)LDH(U/L)對照組97.25±0.11158.63±8.53模型組39.53±0.25①472.22±15.54①OMT 10 μmol/L預(yù)處理組57.40±0.12②367.72±12.53②OMT 50 μmol/L預(yù)處理組77.51±0.23②275.35±12.48②

注：與對照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

2.3 OMT對OS損傷的H9c2心肌細胞凋亡的影響 模型組心肌細胞較對照組胞質(zhì)皺縮，細胞核內(nèi)可見大量藍色熒光(圖2A、B)，通過計算凋亡率，模型組高于對照組[(86.65%±4.31%)vs(11.08%±3.21%)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)OMT低、高濃度預(yù)處理后細胞形態(tài)恢復(fù)，細胞核內(nèi)藍色熒光減少，凋亡率下降(圖2C、D)[(49.02%±4.21%)vs(35.60%±2.62%)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 不同濃度的OMT對H9c2心肌細胞凋亡的影響(Hoechst, ×100)

A．對照組；B.模型組; C. OMT 10 μmol/L預(yù)處理組; D. OMT 50 μmol/L預(yù)處理組

2.4 OMT對OS損傷的H9c2心肌細胞中SOD、MDA、GSH、CAT含量的影響 與對照組比較， 模型組心肌細胞胞內(nèi)SOD、GSH、CAT含量降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，經(jīng)OMT低、高濃度預(yù)處理后細胞內(nèi)SOD、GSH、CAT含量升高，MDA含量下降，且隨著藥物濃度的增加變化顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2)。

2.5 OMT對OS損傷的H9c2心肌細胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、Casepase3 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達影響 通過RT-PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)，模型組較對照組心肌細胞中Bax mRNA、Casepase3 mRNA表達升高，Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達呈上升趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)OMT低、高濃度預(yù)處理后心肌細胞內(nèi)Bcl-2 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達較模型組升高， Bax mRNA、Casepase3 mRNA表達較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

組別SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)GSH(μmol/gprot)CAT(U/ml)對照組193.05±7.541.33±0.0760.46±0.9950.72±1.24模型組64.51±5.37①6.70±0.05①28.43±1.72①21.26±1.01①OMT 10 μmol/L預(yù)處理組90.55±2.27②4.75±0.09②36.87±1.17②34.74±2.41②OMT 50 μmol/L預(yù)處理組130.52±5.94②3.22±0.03②44.69±1.96②44.71±1.66②

注：與對照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

組別Bcl-2BaxCasepase3Nrf2HO-1對照組11111模型組0.33±0.31①2.13±0.11①3.61±0.43①1.59±0.27①1.51±0.46②OMT 10 μmol/L預(yù)處理組0.68±0.43④1.83±0.21④2.71±0.32③1.98±0.33④1.91±0.38④OMT 50 μmol/L預(yù)處理組0.81±0.26③1.63±0.47③1.91±0.57③2.24±0.21③2.22±0.41③

注：與對照組比較，①P<0.01，②P<0.05；與模型組比較，③P<0.01，④P<0.05

2.6 OMT對OS損傷的H9c2心肌細胞Nrf2 、HO-1蛋白表達的影響 Western Blot結(jié)果顯示，模型組心肌細胞較對照組Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，OMT低、高濃度預(yù)處理組心肌細胞Nrf2、HO-1蛋白表達呈上升趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3，表4)。

圖3 不同濃度OMT對H9c2心肌細胞OS損傷后Nrf2和HO-1的western blot 結(jié)果

A. 對照組；B.模型組; C. OMT 10 μmol/L預(yù)處理組; D. OMT 50 μmol/L預(yù)處理組

組別Nrf2HO-1對照組0.87±0.050.54±0.04模型組1.57±0.03①0.73±0.03①OMT 10 μmol/L預(yù)處理組1.88±0.03②0.94±0.03②OMT 50 μmol/L預(yù)處理組1.94±0.05②1.06±0.01②

注：與對照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

3 討 論

OS的實質(zhì)是體內(nèi)氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多，超過了自身清除能力而發(fā)生的溶酶體、線粒體等損傷[13]。H2O2是體內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物之一，通過與細胞核內(nèi)的鐵離子反應(yīng)從而產(chǎn)生活性較強的氧自由基引起細胞損傷，同時它還能夠通過脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物MDA促進蛋白質(zhì)聚合，誘導(dǎo)細胞凋亡[14]。

凋亡即一種程序性死亡，形態(tài)學(xué)變化以細胞皺縮、核溶解及 DNA 斷裂為特征[15]。心肌細胞凋亡以線粒體凋亡途徑為主，該途徑主要由Bcl-2家族參與。Bcl-2家族主要由促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2組成，通過調(diào)節(jié)線粒體膜通透性來確定細胞壞死與細胞凋亡的程度[16]。Caspase家族在細胞凋亡中同樣發(fā)揮著重要作用，當(dāng)Bax結(jié)合到線粒體膜時，線粒體內(nèi)外膜之間的離子濃度發(fā)生改變使細胞色素C流到細胞質(zhì)中，與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Casepase 9)形成凋亡體并激活Caspase 3誘發(fā)細胞凋亡[17]。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)OMT能夠增加Bcl-2，降低Bax和Casepase 3的mRNA表達量，該結(jié)果與趙陽[11]實驗的蛋白水平表達結(jié)果相吻合，說明OMT可以通過抑制線粒體凋亡途徑保護心肌細胞。另外本次實驗又分別通過形態(tài)學(xué)染色、Hoechst凋亡染色等對該結(jié)論進行補充說明，更加全面地論證OMT這一保護機制。

正常生理狀態(tài)下，血清中LDH含量較低，僅在細胞膜損傷后細胞內(nèi)的LDH才能夠大量釋放，同時SOD作為體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化劑，可以清除體內(nèi)過多的氧自由基，減少線粒體損傷，維持細胞穩(wěn)態(tài)[18，19]。研究發(fā)現(xiàn)OMT預(yù)處理組的細胞上清液中LDH含量和細胞內(nèi)MDA含量較模型組顯著下降，細胞內(nèi)SOD含量明顯升高，說明OMT具有良好的抗氧化損傷作用。這一實驗結(jié)論與趙陽[11]的研究結(jié)論也符合，另外通過對細胞內(nèi)其他抗氧化劑GSH、CAT的含量進行測定也得出了相同結(jié)論，充分證明了OMT提升細胞抗氧化能力的作用。但OMT在心肌細胞損傷中的抗氧化機制目前并不清楚，同時這也是本次實驗的研究重點，希望通過進一步了解OMT的保護機制為今后研發(fā)新型抗心肌損傷藥物提供新的參考方向。

正常情況下Nrf2在細胞質(zhì)中與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1重組蛋白(recombinant kelch like ECH associated protein 1，Keap1)以無活性的二聚體形式存在，受到OS損傷后迅速與Keap1分離并進入細胞核。在細胞核內(nèi)，通過啟動下游能夠編碼抗氧化蛋白基因和Ⅱ相抗氧化酶HO-1等的表達發(fā)揮保護作用[20]。同時有研究表明，Nrf2還能夠上調(diào)Bcl-2的表達發(fā)揮抗凋亡作用[21]。本次實驗通過RT-PCR與Western Blot分別從RNA與蛋白水平上發(fā)現(xiàn)OMT能夠通過增加Nrf2的核轉(zhuǎn)移和下游基因HO-1的表達發(fā)揮抗氧化作用，表明OMT的抗氧化作用可能與Nrf2/ HO-1信號通路有關(guān)。但通過上游哪些基因轉(zhuǎn)錄激活Nrf2進入細胞核，同時產(chǎn)生哪些細胞因子促使其激活下游HO-1目前尚不清楚，因此在后續(xù)的實驗過程中應(yīng)加以研究探討。

綜上所述，OMT對OS損傷的H9c2心肌細胞具有保護作用，其作用機制可能與OMT上調(diào)Nrf2/ HO-1信號通路，提高心肌細胞內(nèi)SOD、GSH、CAT等抗氧化酶活性，抑制細胞凋亡有關(guān)。希望通過對OMT分子機制的研究使其作用靶點逐漸明確，為今后臨床用藥提供理論依據(jù)。