黃旭華　何強　湯慶坤　蔣滿貴　李田　龍江瓊　潘國慶　鄭寧　魯成　潘志新

黃旭華（1978-），高級農(nóng)藝師，廣西“新世紀十百千人才工程”第二層次人選，2019年廣西“最美科技工作者”，主要從事蠶病防控技術(shù)研究工作。主持完成國家自然科學(xué)基金項目“家蠶與野外昆蟲間微孢子蟲交叉?zhèn)魅拘约捌鋫魅緳C制”、廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目“廣西家蠶微粒子病防控技術(shù)研究與應(yīng)用”、廣西自然科學(xué)基金項目“廣西桑園主要昆蟲的微孢子蟲資源調(diào)查及其對家蠶感染研究”、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西創(chuàng)新團隊桑蠶病蟲害崗位項目等;參與完成國家自然科學(xué)基金項目、廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目等國家級、省部級項目10余項。在《Journal of Basic Microbiology》《Analyst》《Applied Microbiology and Biotechnology》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報》《蠶業(yè)科學(xué)》等國內(nèi)外期刊發(fā)表科技論文40余篇。獲得國家發(fā)明專利1項。

摘要：【目的】研究從廣西蠶種繁育中分離獲得的微孢子蟲，調(diào)查其感染性和分類地位，為蠶種生產(chǎn)掌握病原來源及有效控制家蠶微粒子病流行提供參考依據(jù)。【方法】采用生物試驗測定從蠶種生產(chǎn)一線分離獲得微孢子蟲（GXM14）對家蠶的半數(shù)感染濃度（IC50）和胚種傳染率，顯微鏡觀察其孢子形態(tài)，采用吉姆薩染色法觀察孢子的生活史;通過PCR擴增及測序獲得GXM14的SSU rRNA基因序列和ITS 序列，并利用MEGA 5.0和DNASTAR中的Megalign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹及進行相似性和遺傳距離分析?！窘Y(jié)果】GXM14孢子呈卵圓形，大小為（1.68±0.15）μm×（3.06±0.15）μm，其孢子生活史中有雙核，以二分裂方式進行增殖，符合Nosema屬的特征。GXM14對家蠶的IC50為3.53×105個/mL，是家蠶微孢子蟲（N.b）的5.8倍;對家蠶的胚種傳染率為5.0%，只是N.b的1/9。GXM14的SSU rRNA基因序列長度1226 bp，G+C含量為34.42%;ITS序列長度503 bp，G+C含量為29.82%。GXM14的SSU rRNA基因序列與甜菜夜蛾微孢子蟲（Nosema sp. SE）SSU rRNA基因序列（KT336240.1）的遺傳距離為0.2，相似度達98.9%，即GXM14與甜菜夜蛾微孢子蟲（KT336240.1）的親緣關(guān)系很近?；谖㈡咦酉xITS序列的相似性和遺傳距離分析結(jié)果表明，GXM14與12株已知Nosema屬微孢子蟲的相似度均低于91.0%，而遺傳距離在4.0以上，證實GXM14是一種新的微孢子蟲，故將其暫命名為Nosema sp. GXM14?！窘Y(jié)論】從蠶種生產(chǎn)一線分離獲得的家蠶病原性微孢子蟲（GXM14）屬于Nosema屬，與N.b同屬異種，是一株新的微孢子蟲，可能是野外昆蟲微孢子蟲交叉感染家蠶的病原。因此，在蠶種繁育中加強防蟲殺蟲，防止昆蟲微孢子蟲污染桑葉交叉感染家蠶，是控制家蠶微粒子病暴發(fā)流行的重要措施。

關(guān)鍵詞： 家蠶;微孢子蟲;蠶種繁育;感染性;Nosema屬

中圖分類號： S884.21? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）01-0011-08

Abstract：【Objective】The present study was conducted to investigate the pathogenicity and classification feature of the microsporidian that was isolated from silkworms（Bombyx mori） in egg production， that would provide reference basis for the pathogen sources and the control of pebrine in silkworm egg production. 【Method】GXM14 microspofidian was isolated from the parent silkworm in silkworm egg production line. The 50% infectious concentration（IC50） and the germinative infection rate of GXM14 were investigated with biological test methods， the spore shape of GXM14 was observed with optical microscope， and its life cycle was observed with Giemsas staining. The small subunit ribosomal RNA （SSU rRNA） gene and rRNA ITS sequence of GXM14 were obtained by PCR amplification， cloning and sequencing， the phylogenetic tree based on SSU rRNA sequences was constructed with the software of MEGA5 ， and the genetic distance of SSU rRNA and rRNA ITS sequence were analyzed with Megalign in software of DNASTAR. 【Result】The IC50 of GXM14 to silkworm was 3.53×105 ind/mL，which was 5.8 times to that of Nosema bombycis（N.b）， and the germinative infection rate of GXM14 was 5.0%， which was only 1/9 of that of N.b. The spore of GXM14 was oval in shape and （1.68±0.15）μm×（3.06±0.15）μm in size. There was binuclear in the life cycle of GXM14， and propagated in binary fission， which was conformed to the taxonomic features of Nosema. The SSU rRNA gene sequence of GXM14 was 1226 bp long， the G+C content was 34.42%， the rRNA ITS sequence of GXM14 was 503 bp long， the G+C content was 29.82%. The SSU rRNA genetic distance of GXM14 and Nosema sp. SE（KT336240.1） was 0.2， and its similarity was 98.9%， showed that GXM14? had close relationship with Nosema sp. SE. Analysis on rRNA ITS of microsporidian indicated that the similarity of GXM14 and 12 known Nosema microsporidian isolates were all lower than 91.0%， and their genetic distance were more than 4.0. It showed that GXM14 was a new Nosema microsporidian， and named Nosema sp. GXM14. 【Conclusion】There is a pathogenic microsporidan（GXM14） of silkworm that is isolated from the silkworm in egg production line. GXM14 is a new Nosema microsporidian， GXM14 and N.b belong to different species of the same genus. It is probable that GXM14 is transmitted by wild insect in the process of silkworm egg production. Therefore， the working of pest control for preventing the cross-infection microsporidium from wild insects to silkworm through mulberry leaf has practical value on the prevention of microsporidiosis for silkworm.

Key words： Bombyx mori; microspofidian; silkworm egg production; pathogenicity; Nosema

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31560048，31460035）; State Key Laboratory of Mulberry Silkworm Genome Biology Open Project（2016）

0 引言

【研究意義】家蠶微粒子病是一種具有食下傳染和胚種傳染的蠶病，也是蠶種生產(chǎn)中唯一的檢疫對象，《蠶種管理辦法》規(guī)定所有生產(chǎn)蠶種必須通過檢疫合格才能應(yīng)用于蠶業(yè)生產(chǎn)（浙江大學(xué)，2000;黃旭華等，2018a）。據(jù)統(tǒng)計，我國蠶種生產(chǎn)每年因感染微粒子病的檢疫淘汰率均在3.0%以上，約數(shù)十萬張蠶種遭淘汰，經(jīng)濟損失十分嚴重（徐杰等，2015）。此外，在蠶種檢疫中常出現(xiàn)一些與典型家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis，N.b）孢子形態(tài)大小不同的異型微孢子蟲，但這些異型微孢子蟲的感染力及分類地位尚未明確，極大影響蠶種檢疫工作的開展（鄭祥明等，1999;魯興萌和邵勇奇，2016）。因此，在蠶種繁育過程中調(diào)查異型微孢子蟲來源，明確其感染力和分類地位，對蠶種生產(chǎn)中有效防控家蠶微粒子病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】微粒子病是一種危害性非常嚴重的家蠶傳染病，1870年法國科學(xué)家巴斯德創(chuàng)立的“母蛾檢驗，淘汰病蛾所產(chǎn)蠶卵，應(yīng)用無毒蠶種”方法為防控家蠶微粒子病提供了重要手段（萬永繼，2005），但隨著蠶業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，蠶種檢疫中常出現(xiàn)異型微孢子蟲干擾的問題。早在20世紀60—70年代，日本蠶業(yè)科學(xué)家為了完善家蠶微粒子病防控方法，曾對感染家蠶的異型微孢子蟲進行深入研究，并相繼從家蠶體內(nèi)分離獲得具褶孢蟲屬的M25和M27（Pleistophora spp.）、泰羅漢孢蟲M32（Thelohania sp.）及變形孢蟲M12（Vairimolpha sp.）等異型微孢子蟲（Takeshi，2003）。從20世紀末開始，在我國蠶業(yè)傳統(tǒng)強省也有諸多學(xué)者開展了異型微孢子蟲感染家蠶的相關(guān)研究。方定堅等（1991）從廣州石牌地區(qū)飼養(yǎng)的家蠶原種母蛾中分離出2株異型微孢子蟲MG1和MG2，但在形態(tài)構(gòu)造、病原性和血清學(xué)性狀等方面與N.b存在明顯差異;萬永繼等（1995）研究了SCM微孢子蟲，證實其與N.b異屬異種，對家蠶胚種傳染力很弱;沈中元和徐莉（2001）從蠶蛾中分離獲得一種小型微孢子蟲MZ1，其形狀呈卵圓形，寄生在家蠶的大多數(shù)組織器官，可經(jīng)胚種傳染給下一代;潘敏慧等（2002）對家蠶微孢子蟲SCM8進行研究，發(fā)現(xiàn)SCM8僅感染寄生于家蠶的中腸上皮組織，具食下傳染力，但無胚種傳染力，致病力較弱;時連根等（2002）從家蠶體中分離到一種新的病原性微孢子蟲SLN1，主要感染寄生于家蠶肌肉、氣管上皮細胞和脂肪等組織，致病性弱，胚種傳染率低;Meng等（2018）從家蠶分離獲得一株變形孢仔蟲V. necatrix BM，并證實其對家蠶無胚種傳染性。隨著廣西蠶業(yè)的快速發(fā)展，廣西學(xué)者也相繼開展了家蠶異型微孢子蟲的調(diào)查研究。羅梅蘭等（2012）從家蠶體內(nèi)分離得到一株新的病原性微孢子蟲GXM1，與N.b同屬異種，但對家蠶食下感染和胚種感染均較低;黃旭華等（2012a）從家蠶體內(nèi)分離獲得另一株病原性微孢子蟲GXM2，并證實該微孢子蟲對家蠶具有較強的食下感染力，但只有輕微的胚種傳染力，與N.b異屬異種，屬于Vairimorpha屬?！颈狙芯壳腥朦c】蠶種微粒子病檢疫出現(xiàn)的異型微孢子蟲是蠶種繁育過程中飼養(yǎng)家蠶感染所造成，因此追蹤蠶種繁育過程病原性微孢子蟲的感染情況，并明確其感染性和遺傳系統(tǒng)發(fā)育規(guī)律，可為深入研究病原性微孢子蟲對蠶種生產(chǎn)的危害打下基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】深入研究從廣西蠶種繁育中分離獲得的微孢子蟲，調(diào)查其感染性和分類地位，為蠶種生產(chǎn)掌握病原來源及有效控制家蠶微粒子病暴發(fā)流行提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試異型微孢子蟲從廣西貴港市蠶種場原蠶點飼養(yǎng)的原蠶分離獲得，編號為GXM14;N.b由廣西蠶業(yè)科學(xué)研究院桑蠶病蟲害研究室繼代保存。分別取GXM14和N.b兩種微孢子蟲接種二齡起蠶，飼養(yǎng)12 d后（五齡第2 d），取發(fā)病蠶體進行提取、純化與精制微孢子蟲（黃旭華等，2013）。供試家蠶品種為932×芙蓉。

1. 2 GXM14形態(tài)觀察

將純化的GXM14和N.b孢子懸浮液制成臨時標本，利用相差顯微鏡（Nikon E200）以600倍進行觀察，并以明美顯微數(shù)碼測量分析系統(tǒng)（v1.0）的測微尺分別測量30個GXM14和N.b的孢子長軸與短軸，比較其形狀差異（黃旭華等，2013）。

1. 3 GXM14生活史觀察

以GXM14孢子懸浮液（濃度3×107個/mL）涂抹桑葉，稍晾干后飼喂二齡起蠶12 h，再用潔凈桑葉繼續(xù)飼育，每隔12 h取出家蠶解剖并采集中腸組織涂抹玻片，以95%甲醇固定5 min后進行吉姆薩染色，清水沖洗，晾干，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察孢子的發(fā)育增殖狀態(tài)（黃旭華等，2012b）。

1. 4 GXM14對家蠶的感染性調(diào)查

1. 4. 1 GXM14對家蠶的食下感染 將GXM14配制成1×107個/mL的孢子懸浮液，再用無菌水以10倍梯度稀釋成4個系列稀釋液（106、105、104和103），分別取各稀釋梯度的孢子懸浮液0.2 mL，涂抹在2片面積為8.0 cm2的桑葉上，稍晾干，飼喂二齡起蠶（30頭）12 h，重復(fù)2區(qū)。各區(qū)家蠶食完含GXM14孢子的桑葉后，更換蠶座紙片，改用潔凈桑葉飼養(yǎng)12 d（五齡第3 d），對各區(qū)家蠶逐頭進行研磨鏡檢，計算孢子感染率，同時以N.b孢子感染為對照。采用Reed Muench法計算半數(shù)感染濃度（IC50）（浙江大學(xué)，2000）。

1. 4. 2 GXM14對家蠶的胚種傳染調(diào)查 將GXM14配制成2.0×105個/mL的孢子懸浮液，取潔凈桑葉浸泡于孢子液中，稍晾干，飼喂五齡起蠶12 h，再以潔凈桑葉飼育至上蔟，化蛹、化蛾后制種，檢驗產(chǎn)卵母蛾，將感染GXM14的重癥母蛾（孢子檢出密度>100個孢子/視野）所產(chǎn)卵圈即時浸酸處理，催青，孵化蟻蠶，飼養(yǎng)至三齡起蠶，逐頭鏡檢（包括死卵），調(diào)查胚種傳染率。

1. 5 GXM14系統(tǒng)發(fā)育分析

1. 5. 1 基因組DNA抽提 參照蔡順風(fēng)等（2011）的方法，取1.0 mL GXM14孢子懸浮液（濃度約1×109個/mL），12000 r/min離心5 min;加入700 μL GP1懸浮，轉(zhuǎn)入專用破碎管中（裝有0.2 g大玻璃珠和0.2 g小玻璃珠），以組織破碎儀破碎3次（40 s/次）;使用植物基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。

1. 5. 2 SSU rRNA基因和ITS序列擴增及測序 參照Huang等（2004）的方法，選取引物18f（5'-CACCA GGTTGATTCTGCC-3'）和1537r（5'-TTATGATCCTC CTAATGGTTC-3'）進行微孢子蟲SSU rRNA基因擴增。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸 10 min。PCR擴增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，并以回收膠試劑盒對目的條帶進行回收;再利用pEASY?-T1 Simple Cloning Kit試劑盒對目的產(chǎn)物進行克隆，將陽性菌落的菌液送至深圳華大基因科技有限公司測序。同時，以引物ILSUF（5'-TGGGTT TAGACCGTCGTGAG-3'）和S33R（5'-ATAGCGTCT ACGTCAGGCAG-3'）進行微孢子蟲ITS序列擴增，PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸 10 min。目的序列的回收、克隆及測序步驟同SSU rRNA基因。

1. 5. 3 序列同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建

參照董世楠等（2009）的方法，對SSU rRNA基因和ITS序列進行同源性比對及遺傳距離分析，并基于SSU rRNA基因序列的相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 GXM14的基本形態(tài)

通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，GXM14的孢子大小較一致，呈卵圓形，整體上比N.b明顯偏小。測量獲得兩種微孢子蟲（GXM14和N.b）的長軸和短軸如表1所示，GXM14孢子的體積僅是N.b孢子的56%。GXM14孢子和N.b孢子具有相同的折光性，在普通光學(xué)顯微鏡下均呈淡綠色（圖1）。

2. 2 GXM14的生活史

采用吉姆薩染色法觀察GXM14在家蠶中腸組織中的增殖情況，發(fā)現(xiàn)GXM14在家蠶中腸組織中增殖的裂殖體階段（48 h）可見球形雙核（圖2-A），且以二分裂方式進行增殖，最終形成2個雙核的成熟孢子（圖2-B）。GXM14發(fā)育周期約108 h，其發(fā)育模式符合Nosema屬的特征。

2. 3 GXM14對家蠶的致病性

2. 3. 1 GXM14對家蠶的IC50 分別以GXM14和N.b的梯度濃度孢子懸浮液感染家蠶二齡起蠶。在孢子高濃度感染區(qū)（×107和×106個/mL），兩種微孢子蟲感染家蠶在三齡后期開始出現(xiàn)發(fā)育緩慢現(xiàn)象，入眠約推遲6 h;四齡起蠶表皮縮皺，體色深暗，行動遲緩，入眠困難，入眠約推遲12 h，出現(xiàn)不蛻皮或半蛻皮的家蠶，且N.b感染區(qū)的家蠶發(fā)病癥狀較GXM14感染區(qū)更明顯;在孢子低濃度感染區(qū)（×105、×104和×103個/mL），兩種微孢子蟲感染家蠶的生長發(fā)育與空白對照無明顯差異。經(jīng)計算獲得，GXM14對家蠶的IC50為3.53×105個/mL，N.b對家蠶的IC50為6.00×104個/mL，即GXM14對家蠶的IC50是N.b的5.8倍，說明GXM14對家蠶雖然有較強的食下感染力，但明顯低于N.b。

2. 3. 2 GXM14對家蠶的胚種傳染力 利用GXM14孢子感染家蠶五齡起蠶，調(diào)查感染GXM14重癥母蛾（孢子檢出密度>100個孢子/視野）所產(chǎn)蠶卵孵化后代的微孢子蟲感染情況。結(jié)果表明，GXM14對家蠶的胚種傳染率為5.0%，而N.b對家蠶的胚種傳染率為45.0%，表明GXM14對家蠶具有較低胚種傳染力。

2. 4 微孢子蟲的SSU rRNA基因和ITS序列分析結(jié)果

測序結(jié)果表明，GXM14的SSU rRNA基因序列長度1226 bp，G+C含量為34.42%;ITS序列長度503 bp，G+C含量為29.82%?；赟SU rRNA基因序列，利用MEGA 5.0對GXM14及已知的6株微粒子屬（Nosema）、2株鈍孢蟲屬（Amblyospora）、3株內(nèi)網(wǎng)蟲屬（Endoreticulatus）、3株變形孢蟲屬（Vairimorpha）、2株具褶孢蟲屬（Pleistophora）和3株格留蟲屬（Glugea）等微孢子蟲構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以白僵菌（Beauveria bassiana）（EU334679）作為外群，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)GXM14位于Nosema屬類群中，說明GXM14是Nosema屬微孢子蟲，與其生活史觀察等傳統(tǒng)分類結(jié)果一致。同時，采用DNASTAR中的Megalign對GXM14及13株已知微孢子蟲和白僵菌的SSU rRNA基因序列進行相似性和遺傳距離分析，結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)GXM14的SSU rRNA基因序列與甜菜夜蛾微孢子蟲（Nosema sp. SE）SSU rRNA基因序列（KT336240.1）的遺傳距離為0.2，相似度達98.9%，說明GXM14與甜菜夜蛾微孢子蟲（KT336240.1）的親緣關(guān)系很近。此外，基于微孢子蟲ITS序列的相似性和遺傳距離分析結(jié)果表明，GXM14與12株已知Nosema屬微孢子蟲的相似度均低于91.0%，而遺傳距離均在4.0以上（表3），證實GXM14是一種新的微孢子蟲，故將其暫命名為Nosema sp. GXM14。

3 討論

家蠶微粒子病是一種危害最嚴重的傳染性蠶?。ㄈf永繼，2005）。1845年歐洲養(yǎng)蠶業(yè)大面積暴發(fā)家蠶微粒子病，經(jīng)濟損失慘重，雖然法國科學(xué)家巴斯德建立的袋制種母蛾鏡檢法逐步控制了家蠶微粒子病的蔓延，但其危害致使歐洲蠶業(yè)持續(xù)衰落及萎縮（周澤揚等，2014）;在日本和我國蠶區(qū)也曾暴發(fā)過嚴重的家蠶微粒子病，尤其在20世紀80年后期我國蠶區(qū)每年因家蠶微粒子病而燒毀的蠶種約占總產(chǎn)量的10%，即超過100萬張蠶種因感染微孢子蟲而被淘汰（徐杰等，2015）。進入21世紀，廣西蠶業(yè)規(guī)模迅速擴大，已逐漸發(fā)展成為世界最重要的蠶繭生產(chǎn)基地，與此同時廣西蠶種繁育深受家蠶微粒子病威脅，大量蠶種因母蛾檢疫攜帶微孢子蟲而被淘汰。掌握病原來源是控制流行性疾病的首要條件（呂抒真等，2014），本課題組前期在蠶種生產(chǎn)一線調(diào)查感染家蠶的病原性微孢子蟲，結(jié)果從廣西貴港市蠶種場原蠶點飼養(yǎng)的家蠶中分離獲得一株微孢子蟲（GXM14），以期為蠶種生產(chǎn)中溯源家蠶微粒子病病原提供參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，GXM14對家蠶的食下和胚種感染力均較弱，GXM14對家蠶的IC50是N.b的5.8倍，GXM14對家蠶的胚種傳染率為5.0%，只是N.b的1/9，即GXM14的感染性較差，與前期對一些家蠶異型微孢子蟲和昆蟲微孢子蟲的研究結(jié)果（黃旭華等，2018a，2018b）一致。此外，GXM14的形態(tài)大小明顯比N.b小，其生活史觀察發(fā)現(xiàn)具有雙核，以二分裂方式進行增殖，具備Nosema屬的典型特征;從基于微孢子蟲SSU rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也發(fā)現(xiàn)GXM14屬于Nosema屬，與甜菜夜蛾微孢子蟲Nosema sp. SE（KT336240.1）的相似度達98.9%，二者的親緣關(guān)系很近;而基于ITS序列的相似性和遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，GXM14與其他Nosema屬微孢子蟲的相似度均低于91.0%，而遺傳距離在4.0以上，證實GXM14是一株新的Nosema屬微孢子蟲，暫命名為Nosema sp. GXM14。

本研究還追蹤調(diào)查了檢出GXM14的家蠶的親本蠶種，排除家蠶微粒子病胚種傳染可能性，確定是原蠶飼養(yǎng)過程中環(huán)境污染造成家蠶食下感染GXM14。根據(jù)微孢子蟲的系統(tǒng)發(fā)育進化分析結(jié)果，推測GXM14來源于野外昆蟲（甜菜夜蛾），進一步證明野外昆蟲微孢子蟲交叉感染家蠶是引起蠶種繁育家蠶微粒子病發(fā)生的重要方式（黃旭華等，2018b）。因此，在蠶種繁育過程中加強防蟲殺蟲及采取有效方法凈化桑葉，防止病蟲的糞便或尸體污染桑園桑葉，是控制家蠶微粒子病暴發(fā)流行的重要措施。

4 結(jié)論

從蠶種生產(chǎn)一線分離獲得的家蠶病原性微孢子蟲（GXM14）屬于Nosema屬，與N.b同屬異種，是一株新的微孢子蟲，可能是野外昆蟲微孢子蟲交叉感染家蠶的病原。因此，在蠶種繁育中加強防蟲殺蟲，防止昆蟲微孢子蟲污染桑葉交叉感染家蠶，是控制家蠶微粒子病暴發(fā)流行的重要措施。

參考文獻：

蔡順風(fēng)，何欣怡，何祥康，邱海洪，李光才，何永強，魯興萌. 2011. 一種快速高效制備家蠶微孢子蟲基因組DNA和總蛋白的方法[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，37（6）：1019-1024. [Cai S F，He X Y，He X K，Qiu H H，Li G C，He Y Q，Lu X M. 2011. A protocol for fast and efficient preparation of genomic DNA and total proteins of Nosema bombycis[J]. Science of Sericulture，37（6）：1019-1024.]

董世楠，朱峰，徐莉，沈中元. 2009. 七種微孢子蟲核糖體小亞基基因（SSU rRNA）的克隆及其系統(tǒng)發(fā)育分析[C]//中國蠶學(xué)會. 中國蠶學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)研討會論文集：1-23. [Dong S N，Zhu F，Xu L，Shen Z Y. 2009. Sequence and phylogenetic analysis of SSU rRNA gene of seven microsporidia[C]//Chinese Society of Sericultural Science. Proceedings of the Sixth Youth Academic Symposium：1-23.]

方定堅，廖森泰，鄭祥明，朱德貞，陳漢明，劉雋，祁麗然，盧鏗明，農(nóng)朝志，白碧璋，毛鏗祖，陳錦漢. 1991. 家蠶新微孢子蟲MG1、MG2的研究——I.形態(tài)、病原性和傳播途徑[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，（2）：35-38. [Fang D J，Liao S T，Zheng X M，Zhu D Z，Chen H M，Liu J，Qi L R，Lu K M，Nong C Z，Bai B Z，Mao K Z，Chen J H. 1991. Stu-dies on morphology，pathogenicity and infection path of new Nosema bombysis MG1 and MG2—Ⅰ. Morphology，pathogenicity and infection path[J]. Guangdong Agricultural Sciences，（2）：35-38.]

黃旭華，羅梅蘭，湯慶坤，王桂文，黃深惠，潘國慶，蔣師東，夏青，王霞，毛洪斌，潘志新. 2018a. 家蠶病原性微孢子蟲多樣性調(diào)查分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（6）：1208-1214. [Huang X H，Luo M L，Tang Q K，Wang G W，Huang S H，Pan G Q，Jiang S D，Xia Q，Wang X，Mao H B，Pan Z X. 2018a. Diversity of pathogenic microsporidan of Bombyx mori[J]. Journal of Southern Agriculture，49（6）：1208-1214.]

黃旭華，祁廣軍，湯慶坤，潘志新，羅梅蘭，蔣滿貴，朱方容，黃深惠. 2012a. 一株從家蠶體內(nèi)分離獲得的微孢子蟲GXM2的生物學(xué)特性[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，43（7）：1049-1053. [Huang X H，Qi G J，Tang Q K，Pan Z X，Luo M L，Jiang M G，Zhu F R，Huang S H. 2012a. Biological characteristics of a strain of microsporidia GXM2 isolated from silkworm[J]. Journal of Southern Agriculture，43（7）：1049-1053.]

黃旭華，祁廣軍，湯慶坤，潘志新，朱方容，黃元姣，林強，羅梅蘭，石美寧，吳勇滸，黃深惠. 2012b. 從野外昆蟲體內(nèi)分離的5株微孢子蟲的生物學(xué)特性與分子系統(tǒng)發(fā)育研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，38（5）：864-872. [Huang X H，Qi G J，Tang Q K，Pan Z X，Zhu F R，Huang Y J，Lin Q，Luo M L，Shi M N，Wu Y H，Huang S H. 2012b. Biological characters and molecular phylogenesis of five microsporidia isolated from field insects[J]. Science of Sericulture，38（5）：864-872.]

黃旭華，祁廣軍，湯慶坤，潘志新，朱方容，劉玉生，于先哲，羅梅蘭，蔣滿貴，石美寧，唐亮，虞崇江. 2013. 從稻縱卷葉螟分離的一株微孢子蟲的生物學(xué)特性與分子系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，39（3）：543-550. [Huang X H，Qi G J，Tang Q K，Pan Z X，Zhu F R，Liu Y S，Yu X Z，Luo M L，Jiang M G，Shi M N，Tang L，Yu C J. 2013. Biolo-gical characters and molecular phylogenetic analysis of a microsporidium strain isolated from Cnaphalocrocis medinalis[J]. Science of Sericulture，39（3）：543-550.]

黃旭華，湯慶坤，羅梅蘭，黃深惠，蔣師東，夏青，黃景灘，李安華，魯成，陳小青，毛洪斌，潘志新. 2018b. 廣西昆蟲微孢子蟲資源調(diào)查及其特性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（8）：1541-1547. [Huang X H，Tang Q K，Luo M L，Huang S H，Jiang S D，Xia Q，Huang J T，Li A H，Lu C，Chen X Q，Mao H B，Pan Z X. 2018b. Investigation on resource of insect microsporidan in Guangxi and its characters[J]. Journal of Southern Agriculture，49（8）：1541-1547.]

魯興萌，邵勇奇. 2016. 家蠶微粒子病防控技術(shù)研究的發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，42（6）：945-952. [Lu X M，Shao Y Q. 2016. A review on current status and development trend of pebrine prevention and control technology[J]. Science of Sericulture，42（6）：945-952.]

羅梅蘭，黃旭華，潘志新，蔣滿貴，湯慶坤，黃深惠，安春梅，胡文娟，甘麗紅. 2012. 一株家蠶病原性微孢子蟲的生物學(xué)特性與分子系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，38（5）：856-863. [Luo M L，Huang X H，Pan Z X，Jiang M G，Tang Q K，Huang S H，An C M，Hu W J，Gan L H. 2012. Biological characters and molecular phylogenetic analysis of a microsporidian isolate pathogenic to Bombyx mori[J]. Science of Sericulture，38（5）：856-863.]

呂抒真，范兆軍，李天憲，閻保平. 2014. 我國重要自然宿主及媒介昆蟲病毒性病原調(diào)查本體的構(gòu)建與應(yīng)用[J]. 科研信息化技術(shù)與應(yīng)用，5（4）：53-61. [Lü S Z，F(xiàn)an Z J，Li T X，Yan B P. 2014. Construction and application of the investigation ontology for viral pathogens in important na-tural hosts and insect vectorsn[J]. E-science Technology & Application，5（4）：53-61.]

潘敏慧，萬永繼，祝仁英. 2002. 家蠶病原性微孢子蟲SCM8的研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，28（2）：115-119. [Pan M H，Wan Y J，Zhu R Y. 2002. Studied on a microsporidium（SCM8） pathogenic for the Silkworm，Bombyx mori[J]. Acta Sericologica Sinica，28（2）：115-119.]

沈中元，徐莉. 2001. 從家蠶蛾中分離的微孢子蟲MZ1（Nosema sp.）對家蠶的病原性研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，27（3）：197-199. [Shen Z Y，Xu L. 2001. Studies on the pathogenicity of a microsporidium MZ1（Nosema sp.） to the silkworm，Bombyx mori[J]. Acta Sericologica Sinica，27（3）：197-199.]

時連根，劉淑梅，徐俊良. 2002. 從家蠶體分離的一種新微孢子蟲SLN1的研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，28（3）：211-214. [Shi L G，Liu S M，Xu J L. 2002. Study on a new microspori-dium SLN1 isolated from the silkworm，Bombyx mori[J]. Acta Sericologica Sinica，28（3）：211-214.]

萬永繼. 2005. 家蠶病原性微孢子蟲若干種群的研究與控制[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué). [Wan Y J. 2005. Study and control on several population of pathogenic microspori-dian in the silkworm，Bombyx mori（Bombycidae，Lepidoptera）[D]. Beijing：China Agricultural University.]

萬永繼，張琳，陳祖佩，潘敏慧，杜云，敖明軍，楊彪. 1995. 家蠶病原性微孢子蟲SCM7（Endoreticulatus.sp）的分離和研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，21（3）：168-172. [Wan Y J，Zhang L，Chen Z P，Pan M H，Du Y，Ao M J，Yang B. 1995. Study of a pathogenic microsporidium SCM7 （Endoreti-culatus. sp） isolated from the larvae of silkworm，Bombyx mori[J]. Acta Sericologica Sinica，21（3）：168-172.]

徐杰，陳靈方，樓霞，朱春群. 2015. 浙江省蠶種微粒子病防治的現(xiàn)狀與對策[J]. 蠶桑通報，46（3）：1-3. [Xu J，Chen L F，Lou X，Zhu C Q. 2015. Present situation and countermeasures of silkworm pebrine disease prevention and control in Zhejiang Province[J]. Bulletin of Sericulture，46（3）：1-3.]

浙江大學(xué). 2000. 家蠶病理學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社：148-173. [Zhejiang University. 2000. Histopathology of silkworm[M]. Beijing：China Agriculture Press：148-173.]

鄭祥明，楊瓊，黃炳輝，廖森泰，方定堅，黃星光，余愛群，徐興耀，盧鏗明. 1999. 家蠶分離的微孢子蟲Vairimorpha sp. MG4的研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，25（4）：225-229. [Zheng X M，Yang Q，Huang B H，Liao S T，F(xiàn)ang D J，Huang X G，Yu A Q，Xu X Y，Lu K M. 1999. Study on a microspori-dian Vairimorpha MG4 separated from silkworm，Bombyx mori[J]. Acta Sericologica Sinica，25（4）：225-229.]

周澤揚，潘國慶，李田，許金山. 2014. 家蠶微孢子蟲基因組生物學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社：2-3. [Zhou Z Y，Pan G Q，Li T，Xu J S. Genome biology of Nosema bombycis[M]. Beijing：Science Press：2-3.]

Huang W F，Tsai S J，Lo C F Y，Soichi Y，Wang C H. 2004. The novel organization and complete sequence of the ribosomal RNA gene of Nosema bombycis[J]. Fungal Genetics and Biology，41（5）：473-481.

Meng X Z，Luo B，Tang X Y，He Q，Xiong T R，F(xiàn)ang Z Y，Pan G Q，Li T，Zhou Z Y. 2018. Pathological analysis of silkworm infected by two microsporidia Nosema bombycis CQ1 and Vairimorpha necatrix BM[J]. Journal of Invertebrate Pathology，153：75-84.

Takeshi K. 2003. Biology of microsporidians infecting the silkworm，Bombyx mori，in Japan[J]. Journal of Insect Biotechnology Sericology，72（1）：1-32.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）